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    新型冠狀病毒抗體水平檢測方法的比較

    2021-12-21 09:13:14杜麗芳侯亞楠雷澤華袁潤余梁宇韓子泊唐芳李啟明
    中國生物制品學雜志 2021年12期
    關(guān)鍵詞:微量一致性疫苗

    杜麗芳,侯亞楠,雷澤華,袁潤余,梁宇,韓子泊,唐芳,李啟明

    1.國藥中生生物技術(shù)研究院,北京101111;2.廣東省疾病預防控制中心,廣東廣州511430

    新型冠狀病毒是β 屬冠狀病毒,為單股正鏈RNA 病毒,有包膜,顆粒呈圓形或橢圓形,直徑60 ~140 nm,人群普遍易感,主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播,污染物品及氣溶膠也具有傳播風險。多數(shù)患者預后良好,少數(shù)患者病情危重甚至死亡,多見于老人、有慢性基礎(chǔ)疾病人群、晚期妊娠和圍產(chǎn)期女性、肥胖人群[1-4]。新型冠狀病毒自發(fā)現(xiàn)以來迅速在全球蔓延,并在全球范圍內(nèi)持續(xù)流行。WHO 官網(wǎng)顯示,截至2021 年11 月12 日,全球共有251 788 329人確診為新型冠狀病毒肺炎,其中有5 077 909 人死亡[5]。

    新型冠狀病毒感染人體的關(guān)鍵在于S 蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2 ACE2)蛋白的結(jié)合。兩者結(jié)合后,存在于宿主細胞表面的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)清除 ACE2 并激活 S 蛋白,S 蛋白的激活導致構(gòu)象改變,并允許病毒進入宿主細胞。細胞膜上的外肽酶TMPRSS2 和細胞內(nèi)的組織蛋白酶 cathepsin B / L 將 S 蛋白的 S1 / S2 切開[6]。因此S 蛋白是病毒進入的主要決定因素,也是藥物治療、疫苗研發(fā)的重要靶點[7]。

    本研究利用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞重組表達新型冠狀病毒S 蛋白受體結(jié)合區(qū)(RBD)蛋白制備的重組新型冠狀病毒疫苗,免疫大鼠后,采用不同方法檢測大鼠血清中特異性IgG 抗體和中和抗體水平,以分析不同檢測方法的相關(guān)性和一致性,為疫苗有效性評價提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SPF 級 Wistar 大鼠,6 ~ 8 周齡,體重150 ~ 200 g,共40 只,雌雄各半,分籠飼養(yǎng),購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動物合格證號:110324201102113753。本實驗均以科研為目的進行Wistar 大鼠的養(yǎng)殖和使用,且按照《北京市實驗動物倫理審查指南》相關(guān)規(guī)定進行。

    1.2 新型冠狀病毒假病毒及野病毒 假病毒(包含新型冠狀病毒S 蛋白的VSVΔG 病毒)由中國食品藥品檢定研究院性病與艾滋病室提供,其中S 蛋白基因序列來自Wuhan-Hu-1 毒株(GenBank 序列號:MN908947),報告基因為螢火蟲熒光素酶;野病毒由廣東省疾病預防控制中心提供,分離自廣東省,病毒株編號為2020XN4276 株。

    1.3 疫苗及細胞 重組新型冠狀病毒疫苗由國藥中生生物技術(shù)研究院制備并提供;Huh-7 細胞由中國食品藥品檢定研究院性病與艾滋病室提供;Vero-E6 細胞由廣東省疾病預防控制中心提供。

    1.4 主要試劑 RBD 蛋白購自北京義翹神州科技股份有限公司(貨號:40592-V08B);HRP 標記的山羊抗大鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號:ZB2305);鋁佐劑購自丹麥Croda Denmark(貨號:21645-51-2)。

    1.5 動物免疫 將Wistar 大鼠分為5 組,每組8 只。1 ~ 3 組免疫劑量分別為 10、20 和 40 μg / 劑,共接種 3 劑(第 0、3、6 周);4 組免疫劑量為 20 μg / 劑,共接種 2 劑(第 0、3 周);5 組為陰性對照組,接種 3劑鋁佐劑。均經(jīng)肌肉注射,0.5 mL / 只(雙側(cè)后腿各0.25 mL),免疫1 周后經(jīng)尾靜脈采血,分離血清,每周1 次,共7 次。檢測特異性IgG 抗體和中和抗體水平,共檢測280 份血清樣本。

    1.6 特異性IgG 抗體水平檢測 采用ELISA 法。將RBD 蛋白稀釋至 1 μg /mL,包被酶標板,100 μL /孔,2 ~8 ℃孵育10 ~ 12 h;用含20%牛血清的稀釋液封閉2 h;免疫血清進行系列稀釋(初始稀釋度為1 ∶100)后加至酶標板中,100 μL / 孔,37 ℃孵育 1 h;洗板,加入HRP 標記的山羊抗大鼠IgG(1 ∶10 000稀釋),100 μL / 孔,37 ℃孵育 1 h;洗板,顯色并讀取吸光度值(A450/630)。特異性IgG 抗體效價為 ≥ cutoff 值的血清最高稀釋度的倒數(shù)。

    1.7 中和抗體水平檢測

    1.7.1 假病毒微量中和試驗 將待測血清樣本進行系列稀釋(初始稀釋度為 1 ∶40),取 50 μL 稀釋后血清與50 μL 新型冠狀病毒假病毒[工作濃度為(1 ~ 2)× 104TCID50/ m L]混合,37 ℃孵育 1 h;將Huh-7 細胞懸液(2 × 105個 / mL)加至含有血清和假病毒混合液的 96 孔培養(yǎng)板中,100 μL / 孔,同時設(shè)空白對照(不含假病毒)和陰性對照(含假病毒),37 ℃培養(yǎng)20 ~ 28 h。根據(jù)各孔RLU 值,采用Reed-Muench 法計算50%感染抑制率時血清稀釋倍數(shù),即為該血清樣品的中和抗體滴度。

    1.7.2 野病毒微量中和試驗 該試驗在廣東省疾病預防控制中心BSL-3 級實驗室完成。將待測血清樣本進行系列稀釋(初始稀釋度為 1 ∶40),取 60 μL 稀釋后血清與60 μL 新型冠狀病毒野病毒(2 × 103TCID50/mL)混合,37 ℃孵育2 h;取 100 μL 血清與野病毒的混合液加至含 Vero-E6 細胞(2 × 105個 / mL)的 96 孔細胞培養(yǎng)板中,同時設(shè)空白對照(不含野病毒)和陰性對照(含野病毒),37 ℃培養(yǎng)5 ~7 d。觀察細胞病變情況,采用Karber 法計算50%感染抑制率時血清稀釋倍數(shù),即為該血清樣品的中和抗體滴度。

    1.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Spearman 秩相關(guān)對3 種方法進行相關(guān)性分析,采用kappa 檢驗對3 種方法進行一致性分析(kappa ≥ 0.75,兩者一致性好;0.75>kappa ≥ 0.4,兩者一致性一般;kappa < 0.4,兩者一致性較差)。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 相關(guān)性分析 ELISA 法與假病毒微量中和試驗、野病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的相關(guān)性均良好(rs分別為 0.926 和 0.884,P < 0.05),假病毒微量中和試驗與野病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的相關(guān)性也良好(rs= 0.925,P < 0.05),見圖 1。將各組檢測結(jié)果分別進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,各組內(nèi)不同檢測方法的相關(guān)性均良好(rs> 0.750,P <0.05),見表1。表明不同方法檢測結(jié)果均具有良好的相關(guān)性。

    圖1 不同檢測方法檢測結(jié)果的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation of determination results by different methods

    表1 各組內(nèi)不同檢測方法的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation of determination results by different methods in various groups

    2.2 一致性分析 ELISA 法與假病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的一致性分析kappa 值為0.899,總符合率為95.71%;ELISA 法與野病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的一致性分析kappa 值為0.759,總符合率為88.93%;假病毒微量中和試驗與野病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的一致性分析kappa 值為0.824,總符合率為91.79%,見表2 ~ 4。表明不同方法檢測結(jié)果的一致性均較好。對3 種方法不同采血時間樣品的檢測結(jié)果進行一致性分析,結(jié)果顯示,不同方法一致性程度與采血時間點有一定相關(guān)性,見表5。

    表2 假病毒微量中和試驗與ELISA 法檢測結(jié)果的一致性分析(例數(shù))Tab.2 Consistency of determination results by pseudovirus neutralization test and ELISA(number of cases)

    表3 野病毒微量中和試驗與ELISA 法檢測結(jié)果的一致性分析(例數(shù))Tab.3 Consistency of determination results by wild virus neutralization test and ELISA(number of cases)

    表4 野病毒微量中和試驗與假病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的一致性分析(例數(shù))Tab.4 Consistency of determination results by wild virus neutralization test and pseudovirus neutralization test (number of cases)

    表5 不同方法檢測不同采血時間點樣本的一致性分析Tab.5 Consistency of determination results of samples determined by different methods at different time points

    3 討 論

    為應對新型冠狀病毒肺炎大流行,全球出臺了多項疫情防控措施并積極組織開展疫苗研發(fā),病毒基因序列的公布更加快了新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)速度。截至2021 年11 月16 日,全球共計194 個新型冠狀病毒疫苗處于臨床前研究階段,132 個新型冠狀病毒疫苗正在進行臨床研究,8 個新型冠狀病毒疫苗獲得緊急使用授權(quán)[8]。新型冠狀病毒的中和抗體是建立保護性免疫的關(guān)鍵,因此,疫苗的免疫原性分析,尤其是中和抗體分析,對于疫苗效力評價非常重要[9]。

    在不同種類新型冠狀病毒疫苗臨床研究中,特異性IgG 抗體和中和抗體水平檢測均是疫苗免疫原性評價的主要指標[10-12]。其中特異性IgG 抗體檢測靶標主要針對S 蛋白或N 蛋白[13],中和抗體檢測主要采用假病毒或野病毒中和試驗。

    野病毒噬斑減少中和試驗是檢測中和抗體的金標準,但對于新型冠狀病毒中和抗體的檢測,其不僅檢測通量低,耗時長,且需在BSL-3 級實驗室完成。假病毒微量中和試驗可彌補野病毒微量中和試驗環(huán)境及設(shè)備的限制,在BSL-2 級實驗室完成,且耗時短[9]。臨床上基于抗原抗體結(jié)合原理的檢測方法有化學發(fā)光法、ELISA 法和免疫熒光法等,其中ELISA法是經(jīng)典的血清學檢測方法,由于其檢測成本低,耗時短,檢測通量相對較大,適合用于產(chǎn)品開發(fā)階段的抗體評價[13]。

    本研究將重組新型冠狀病毒疫苗免疫大鼠,采用ELISA 法、假病毒微量中和試驗和野病毒微量中和試驗檢測大鼠血清特異性IgG 抗體和中和抗體水平,結(jié)果顯示,不同方法檢測結(jié)果的相關(guān)性和一致性良好,這對新型冠狀病毒疫苗的早期研究具有重要指導意義。相比較而言,ELISA 法與野病毒微量中和試驗檢測結(jié)果的相關(guān)性、一致性相對較低,分析其原因為:①不同方法的檢測靈敏度存在差異,部分IgG抗體結(jié)合的抗原表位非中和表位[14-15];②與抗體親和力有關(guān)。檢測結(jié)果不一致樣本多為初次免疫后1或2 周的血清樣本,此時還未完成抗體親和力成熟的過程,因此抗體親和力及中和活性相對較低[16]。

    綜上所述,特異性IgG 抗體和中和抗體均是反映保護效果的重要指標,針對新型冠狀病毒中和抗體是建立保護性免疫的關(guān)鍵,因此在不具備BSL-3級實驗室的條件下,3 種檢測方法的相關(guān)性對于疫苗的早期研發(fā)及概念性驗證階段具有重要指示意義。

    志謝感謝中國食品藥品檢定研究院性病與艾滋病室在假病毒中和試驗中提供的幫助

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