LPMO結(jié)合硫酸水解制備纖維素納米晶體

岑 銘 王玉博 趙 蕾 李佩賢 崔博雅 周美怡 溫洋兵 路福平 劉夫鋒

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457）

通常制備纖維素納米晶體（CNC）主要為酸水解法[1-2]，其中多用質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%左右的硫酸[3-4]。酸水解得到的CNC形態(tài)小、穩(wěn)定性好，但水解時(shí)硫酸所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，硫酸用量大，對(duì)機(jī)械設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，且廢液難以處理，污染生態(tài)環(huán)境。近年來，以生物酶輔助預(yù)水解結(jié)合酸水解制備CNC已有報(bào)道，F(xiàn)acundo等人[5]使用纖維素酶預(yù)水解結(jié)合硫酸制得CNC總得率和粒徑均提高。而生物法現(xiàn)多采用復(fù)合酶水解[2]或單酶水解[6]等，具有廢液處理方便、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[7]，目前所用的酶主要以纖維素酶為主。

裂解性多糖單加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO）是銅離子依賴型氧化酶，根據(jù)序列差異在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZymes,http://www.cazy.org/）中分為7類[8]，其中AA9家族是主要水解纖維素的氧化酶[9]。LPMO作用靶點(diǎn)為β-1,4-糖苷鍵，可氧化纖維素單元C1、C4處，得到的產(chǎn)物分別為醛糖酸、二元醇[10]，其中在C1位置氧化會(huì)產(chǎn)生1個(gè)可解離的羧基[11]，能增加纖維素電位，提高分散性[12]。此外，還有研究報(bào)道LPMO可在C6摻入氧，具體機(jī)理尚不明確[13]。與纖維素酶、聚木糖酶、果膠酶等水解酶相比，LPMO為氧化酶，需要外源電子還原活性位點(diǎn)的金屬銅離子才能發(fā)揮活性。外源電子供體常用抗壞血酸、沒食子酸等小分子還原劑。其次，LPMO可作用于纖維素結(jié)晶區(qū)，通過斷裂β-1，4-糖苷鍵以產(chǎn)生更多還原端——纖維素酶的作用靶點(diǎn)，可加速纖維素酶水解效率[14]。利用LPMO制備纖維素納米纖維已有報(bào)道。如Céline等人[6]通過LPMO水解樺木纖維，與聚木糖酶、外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶水解的紙漿對(duì)比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPMO水解得到的納米纖維素表現(xiàn)出更好的凝膠稠度。Anthi等人[15]利用LPMO處理被囊動(dòng)物外層纖維素被囊，制得高結(jié)晶度的納米纖維素。結(jié)果表明LPMO水解可提高納米纖維素得率，且在纖維素分子上插入的羧基能增加納米晶體的表面電荷，促進(jìn)納米晶體形成。但要使酶保持良好活性，需要配置反應(yīng)緩沖液，導(dǎo)致需要的化學(xué)試劑較多、生產(chǎn)成本較高，此外酶反應(yīng)周期較長(zhǎng)，因此利用生物法制備納米纖維素仍有待進(jìn)一步研究[11,16-17]。

本研究以棉溶解漿為原料，采用LPMO預(yù)水解，結(jié)合硫酸水解法制備CNC。通過對(duì)LPMO預(yù)水解前后棉纖維的微觀形態(tài)變化和制得CNC的微觀形態(tài)、粒徑、結(jié)晶度等表征，以只有硫酸水解的CNC作為對(duì)照，初步探究了LPMO預(yù)水解對(duì)降低制備CNC時(shí)硫酸用量，以期為L(zhǎng)PMO在CNC制備中的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

棉溶解漿，含97.0%的α-纖維素，原始聚合度為860，購于天津木精靈生物科技有限公司。裂解性多糖單加氧酶（LPMO），來源于真菌嗜熱毀絲霉（My?celiophthorathermophilaC1）（GenBank：AKO82493.1），可氧化纖維素C1和C4位點(diǎn)。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸等均為分析純。

機(jī)械攪拌器（RW20，德國IKA公司），X-射線衍射儀（Bruker D8 Advance，德國Bruker公司），溶解與顆粒電荷測(cè)定儀（PCD-04，德國BTG公司），激光粒度分析儀（LS13-320，美國Beckman Coulter公司），掃描電子顯微鏡（JSM-840，日本JEOL有限公司），原子力顯微鏡（Multimode 8 AFM，美國Bruker公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LPMO的純化

LPMO粗酶液中的甘油和雜質(zhì)會(huì)抑制酶活性，因此利用磷酸緩沖液透析粗酶液，得到純LPMO，具體步驟如下。

取磷酸氫二鈉6.84 g、磷酸二氫鈉2.20 g于燒杯中，加入超純水1000 mL，攪拌直至完全溶解，制得pH值=6.0的磷酸緩沖溶液。取分子質(zhì)量為3000 Da的透析袋，將適量粗酶液加入袋內(nèi)密封，浸沒于磷酸緩沖溶液中，透析2天，期間每12 h更換1次緩沖溶液。透析后于4℃冷藏保存。

1.2.2 LPMO預(yù)水解棉纖維

將棉溶解漿粉碎成40目粉狀，稱取200 g于5000 mL燒杯中，按順序加入4000 mL的磷酸緩沖溶液（pH值=6.0）、LPMO（添加量為4 mg/g棉纖維）和400μL的抗壞血酸，將其置于60°C水浴，調(diào)節(jié)攪拌器速度為170 r/min，反應(yīng)7天。反應(yīng)過程中0、2、4、6、7天時(shí)取部分纖維用于SEM觀察與羧基含量測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后將樣品煮沸滅活，抽濾并使用去離子水洗滌后收集。

1.2.3 硫酸水解法制備CNC

實(shí)驗(yàn)組CNC的制備：取10 g（絕干）LPMO預(yù)水解棉纖維和100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%、50%、40%的濃硫酸溶液分別在燒杯中混合均勻，在恒溫恒速攪拌水浴鍋（55℃，170 r/min）中分別反應(yīng)2、3、4 h；將反應(yīng)后的CNC混合液倒入1000 mL的燒杯中加水稀釋至900 mL并用玻璃棒攪拌5 min以終止其反應(yīng)；將CNC攪拌均勻后裝入透析袋，在蒸餾水中進(jìn)行透析，直至pH值為中性；透析后的CNC進(jìn)行超聲處理，4℃冰箱保存。

對(duì)照組CNC的制備：取10 g（絕干）棉纖維和100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的硫酸溶液放入燒杯中混合，在恒溫恒速攪拌水浴鍋(55℃，170 r/min)中反應(yīng)2 h；終止反應(yīng)和CNC提取步驟同上。

1.2.4 得率計(jì)算

使用烘干法對(duì)CNC溶液進(jìn)行水分測(cè)定，CNC得率計(jì)算見公式(1)。

式中，X表示水分含量，g；mx表示CNC溶液質(zhì)量，g；m表示硫酸水解前棉漿質(zhì)量，g；m前表示LPMO預(yù)水解前棉纖維質(zhì)量，g；m后表示LPMO預(yù)水解后棉纖維質(zhì)量，g。

1.3 CNC表征

1.3.1 SEM分析

使用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)LPMO預(yù)水解后的棉纖維表面形貌進(jìn)行觀察，以評(píng)價(jià)纖維表面的破壞程度。制樣時(shí)將棉纖維配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的分散液，經(jīng)超聲除顫后冷凍干燥。凍干的樣品用導(dǎo)電膠粘貼在干凈的銅片上，使用離子濺射鍍膜機(jī)對(duì)其進(jìn)行噴金處理，在10 kV加速電壓下進(jìn)行觀察。

1.3.2 羧基含量測(cè)定

1.3.3 粒徑分析將超聲除顫后的CNC配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%分散液，使用激光粒度儀測(cè)定粒徑。

1.3.4 AFM表征

取10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%CNC分散液加入到90 mL無水乙醇溶液中，超聲除顫。取20μL滴至云母片上，自然風(fēng)干，云母片無樣品面與鐵片粘貼。樣品用原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)行硅探針頭測(cè)試（Scana?syst Air型號(hào)，115μm懸臂，葉尖半徑2 nm，彈簧常數(shù)0.4 N/m，共振頻率約70 kHz）。

1.3.5 FT-IR表征

取稱0.001 g冷凍干燥后的CNC粉末與100 mg KBr混合研磨均勻后，壓制成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對(duì)純KBr晶體進(jìn)行掃描，得到其紅外光譜圖作為背景峰，再對(duì)混合樣品進(jìn)行掃描，得到樣品紅外光譜圖。

1.3.6 XRD分析

采用X-射線衍射儀（XRD）對(duì)干燥CNC粉末進(jìn)行物相分析，測(cè)試角范圍2θ=10°～90°。采用分峰法計(jì)算相對(duì)結(jié)晶度，使用軟件MDI Jade 6進(jìn)行擬合分峰，得到結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)面積，通過公式(2)計(jì)算得出相對(duì)結(jié)晶度。

事業(yè)單位的本質(zhì)為，國有資產(chǎn)出資創(chuàng)立、主要運(yùn)營方向帶有濃郁的社會(huì)公益色彩，并受到黨的直接領(lǐng)導(dǎo)與管控，事業(yè)單位主要為學(xué)校等教育事業(yè)單位、醫(yī)院等衛(wèi)生事業(yè)單位組成。而因事業(yè)單位的特殊性決定，黨對(duì)其掌控力度的強(qiáng)弱至關(guān)重要，而政工工作作為黨控制事業(yè)單位的主要工作內(nèi)容與表現(xiàn)形式，極大增強(qiáng)了事業(yè)單位中黨的實(shí)際控制能力。

式中，XC表示相對(duì)結(jié)晶度；SK表示結(jié)晶區(qū)面積；SA表示非結(jié)晶區(qū)面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 LPMO預(yù)水解對(duì)棉纖維的影響

LMPO預(yù)水解對(duì)棉纖維外觀形貌的影響如圖1所示。由圖1可看出，未經(jīng)水解的棉纖維表面光滑，無凹痕褶皺；當(dāng)預(yù)水解2天時(shí)，纖維表面開始出現(xiàn)橫向的褶皺和縱向的劃痕，這是由于LPMO開始附著在纖維素表面，隨著攪拌帶來的牽引力逐漸移動(dòng)水解形成的痕跡，此時(shí)纖維素?zé)o定形區(qū)開始水解，結(jié)晶區(qū)開始軟化；預(yù)水解4天時(shí)，單根纖維表面一層已經(jīng)被破壞，纖維素粒徑會(huì)因此減少；預(yù)水解6天，纖維表面被破壞，LPMO水解痕跡加深；預(yù)水解7天時(shí)，纖維表面出現(xiàn)大量深刻劃痕，纖維結(jié)構(gòu)顯著破壞且伴有許多纖維素納米纖絲（CNF）出現(xiàn)，這與Koskela等人[11]結(jié)論相符，證明利用LPMO可單獨(dú)制備CNF。綜上，LPMO可強(qiáng)烈破壞纖維結(jié)構(gòu)，增加纖維表面粗糙度，增大比表面積，使硫酸與纖維水解接觸位點(diǎn)增多。

圖1 LPMO預(yù)水解時(shí)間對(duì)棉纖維表面形貌變化的影響（×10000）Fig.1 Effect of LPMO prehydrolysis time on surface morphology of cotton fiber（×10000）

LPMO的氧化作用會(huì)使纖維表面生成羧基基團(tuán)，從而增加纖維負(fù)電性。因此常用纖維素的羧基含量來表征其水解程度。圖2為羧基含量隨LPMO預(yù)水解反應(yīng)時(shí)間的變化。由圖2可看出，隨著LPMO預(yù)水解時(shí)間的增加，羧基含量持續(xù)上升，間接說明棉纖維表面破壞程度加劇。當(dāng)LMPO預(yù)水解時(shí)間為2天時(shí)，棉纖維表面羧基含量迅速增加，為0.0617 mmol/g，當(dāng)預(yù)水解時(shí)間大于2天時(shí)，羧基含量緩慢增加，預(yù)水解時(shí)間為7天時(shí)棉纖維羧基含量增加至0.0883 mmol/g。這可能是因?yàn)轭A(yù)水解前2天，棉纖維表面光滑無附著物，且酶活性處于最高時(shí)期，因此水解速率較快，羧基含量顯著增加。隨著時(shí)間的增加，棉纖維表面被破壞，酶存在空間位阻且活性開始快速下降[8]，因此水解速率下降，羧基含量增速下降。

圖2 LPMO預(yù)水解反應(yīng)時(shí)間對(duì)棉纖維羧基含量的影響Fig.2 Effect of prehydrolysis reaction time of LPMO on carboxyl content of cotton fiber

2.2 CNC的表征

2.2.1 宏觀表征與得率

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸水解得到CNC分散液如圖3所示。由圖3可看出，LMPO預(yù)水解結(jié)合硫酸水解制備的CNC分散液隨著硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低逐漸變得渾濁。預(yù)水解結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%硫酸水解時(shí)，所得CNC分散液與對(duì)照組相接近，同樣為泛藍(lán)色的透明溶液，但是當(dāng)硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至40%時(shí)，CNC分散液變得渾濁。

圖3 CNC宏觀表征圖Fig.3 Macro characterization of CNC

圖4為不同CNC的得率。從圖4可以看出，LPMO預(yù)水解結(jié)合硫酸水解對(duì)提高CNC得率有顯著作用，與對(duì)照組CNC相比，預(yù)水解+50%硫酸制備的CNC得率增加18.4個(gè)百分點(diǎn)；預(yù)水解+60%硫酸制備的CNC得率增加19.4個(gè)百分點(diǎn)。LPMO在預(yù)水解過程中，首先進(jìn)攻纖維素纖維的無定形區(qū)，而后氧化結(jié)晶區(qū)。預(yù)水解后一方面纖維結(jié)構(gòu)受到破壞，比表面積增加；另一方面暴露出更多的結(jié)晶區(qū)，因此在酸處理過程中更易水解，從而實(shí)現(xiàn)得率的提升。

圖4 CNC得率Fig.4 Crystal yield of CNC

2.2.2 羧基和磺酸基總含量

由于羧基、磺酸基均為負(fù)離子基團(tuán)，所以使用電荷滴定儀滴定的電荷含量反應(yīng)的是磺酸基和羧基總含量（以下簡(jiǎn)稱基團(tuán)含量）。不同水解體系得到的CNC中基團(tuán)含量如圖5所示。由圖5可看出，當(dāng)LPMO預(yù)處理結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%硫酸水解時(shí)，制得的CNC基團(tuán)含量最多，其主要原因是LPMO破壞纖維表面，增加了硫酸與纖維素的接觸面，以及硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，使得葡萄糖鏈中插入更多磺酸基團(tuán)。但硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降為50%和40%時(shí)，基團(tuán)總含量降低，小于對(duì)照組，這是因?yàn)榱蛩豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，其水解能力下降[18]，單一硫酸水解時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜50%時(shí)，多數(shù)纖維只能被降解至微米級(jí)[19]。羧基C=O吸收峰處無明顯信號(hào)，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中LPMO在預(yù)水解時(shí)產(chǎn)生的羧基極少，因此在紅外光譜圖中羧基出峰不明顯。

圖5 CNC中羧基和磺酸基總量Fig.5 Total carboxyl and sulfonic groups of CNC

2.3 CNC性能分析

2.3.1 粒徑分析與AFM分析

不同CNC平均粒徑如圖7所示。從圖7可以看出，對(duì)照組CNC平均粒徑為142 nm，而經(jīng)LPMO預(yù)水解后結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%硫酸制得的CNC平均粒徑為120 nm，比對(duì)照組小22 nm；當(dāng)硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，CNC平均粒徑為151 nm，對(duì)照組平均粒徑高9 nm；硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至40%時(shí)，所得CNC平均粒徑較大，為234 nm。隨著硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，平均粒徑逐漸上升，這是因?yàn)榱蛩豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)下降后水解纖維素纖維的能力隨之下降。

圖7 CNC粒徑分析Fig.7 Particle size analysis of CNC

2.2.3 紅外光譜分析

圖6為CNC紅外光譜圖。由圖6可知，3200 cm-1左右處為纖維素分子—OH的吸收峰，在1050 cm-1處有1個(gè)葡萄糖碳環(huán)C—O伸縮振動(dòng)峰，這2個(gè)峰確定樣品為纖維素[20]。1630 cm-1處有水分子—OH的彎曲振動(dòng)峰，1390 cm-1左右處是C—H的彎曲振動(dòng)峰。1200 cm-1處對(duì)應(yīng)磺酸基吸收峰。從圖6中還可看出，4個(gè)樣品在1200 cm-1右旁均有小峰出現(xiàn)，這表明4個(gè)樣品都含有一定量的磺酸基。而1735 cm-1左右處的

圖6 CNC紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of CNC

圖8為CNC的AFM圖。纖維素的任一維尺寸減小至100 nm以內(nèi)即視為制得納米纖維素[21]，圖8中比例尺顯示，4個(gè)CNC樣品中大多數(shù)纖維直徑小于100 nm，呈棒狀，屬于纖維素納米晶體。由圖8(a)和圖8(b)可知，同等質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸水解時(shí)，棉纖維經(jīng)LPMO預(yù)水解后的CNC長(zhǎng)度與直徑均比對(duì)照組小。圖8(a)中CNC有堆積重疊的現(xiàn)象，而圖8(b)中CNC則沒有堆積重疊，該現(xiàn)象表明經(jīng)LPMO預(yù)水解得到的CNC具有更好的分散性。由圖8(c)可知，LPMO預(yù)水解結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%硫酸水解制得的CNC同樣呈較好的分散狀態(tài)，晶體尺寸分布均勻，大小與對(duì)照組接近，符合纖維素納米晶體的要求。由圖8(d)可知，LPMO預(yù)水解結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%硫酸水解得到的CNC尺寸較大，分散性較差，這與粒徑測(cè)量結(jié)果和宏觀表征一致。

圖8 CNC的AFM圖Fig.8 AFM images of CNC

2.3.2 結(jié)晶度分析

纖維素Ⅰ型結(jié)構(gòu)中有4個(gè)晶面，分別為纖維素的（110）（110）（002）（004）4個(gè)晶面，分別對(duì)應(yīng)15.09°、16.86°、23.08°、34.40°處的衍射峰。不同CNC的X-射線衍射圖和相對(duì)結(jié)晶度分別如圖9和表1所示。由圖9可看出，經(jīng)LPMO預(yù)水解制得的CNC仍為纖維素Ⅰ型結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組一致，說明LPMO預(yù)水解和硫酸水解不會(huì)影響最終產(chǎn)物晶型。由表1可知，對(duì)照組CNC的相對(duì)結(jié)晶度為59.8%，經(jīng)LPMO結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%硫酸水解所制得的CNC相對(duì)結(jié)晶度為68.6%；LPMO結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%硫酸水解所制得的CNC相對(duì)結(jié)晶度為66.2%；LPMO結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%硫酸水解所制CNC相對(duì)結(jié)晶度為70.4%；比對(duì)照組分別提高了8.8、6.4和10.6個(gè)百分點(diǎn)。這可能是由于LPMO對(duì)纖維素結(jié)晶區(qū)的作用[11]，當(dāng)LPMO預(yù)水解完成后，纖維素結(jié)晶區(qū)內(nèi)部排列較為疏松的區(qū)域暴露，有助于硫酸水解。此外，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會(huì)影響結(jié)晶度大小，有研究表明，在45℃下，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于63.5%則會(huì)降低結(jié)晶度；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～63.5%時(shí)，結(jié)晶度變化曲線趨于平穩(wěn)[18]。因此可推測(cè)，促使CNC結(jié)晶度提升主要為L(zhǎng)PMO的預(yù)水解作用。

圖9 CNC的XRD圖Fig.9 XRD pattern of CNC

表1 CNC相對(duì)結(jié)晶度Table 1 Relative crystallinity of CNC

3 結(jié)論

本研究使用裂解性多糖單加氧酶（LPMO）預(yù)水解棉溶解漿，再通過硫酸水解制得了CNC，并對(duì)其進(jìn)行了表征。

3.1 通過SEM與羧基測(cè)定結(jié)果表明，LPMO可破壞棉纖維表面，提高羧基含量，但是預(yù)水解時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7天，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。

3.2 同樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%硫酸水解時(shí)，先經(jīng)過LPMO預(yù)水解所得的CNC相比只硫酸水解制備的CNC得率提高19.4個(gè)百分點(diǎn)，羧基和磺酸基總量略增，平均粒徑減少22 nm，結(jié)晶度提高8.8個(gè)百分點(diǎn)；在同樣LPMO預(yù)水解后，隨著硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，CNC的得率和羧基與磺酸基總量隨之減少，平均粒徑隨之升高，而結(jié)晶度與硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無明顯關(guān)系。

3.3 從LPMO的作用效果來看，將LPMO預(yù)水解后結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%硫酸水解的CNC與對(duì)照組相比，平均粒徑增加9 nm，羧基和磺酸基總量略下降，而結(jié)晶度提高6.4個(gè)百分點(diǎn)，得率提高18.4個(gè)百分點(diǎn)。此外根據(jù)AFM表征顯示，50%硫酸水解的CNC已經(jīng)達(dá)到納米水平。因此可得出LPMO可促進(jìn)硫酸水解，使其所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至50%。

綜上，LPMO預(yù)水解加硫解水解能提高CNC性能，增加得率，降低所需硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在CNC工業(yè)化生產(chǎn)方面具有重要價(jià)值。但是LPMO處理周期長(zhǎng)，且預(yù)水解反應(yīng)體系所用的試劑較多，故利用LP?MO預(yù)水解以制備CNC的方法距離工業(yè)應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。