吲達帕胺片在中國健康受試者體內(nèi)的人體生物等效性研究

咸瑞卿，姜樹銀，張迅杰，張乃斌，由鵬飛，薛維麗，賀美蓮，鞏麗萍

（山東省食品藥品檢驗研究院 國家監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101）

吲達帕胺屬噻嗪類利尿劑，20世紀80年代開始應用于臨床。該藥物通過利尿作用及鈣拮抗劑活性發(fā)揮療效，用于治療輕、中度高血壓，方便長效，為臨床治療高血壓癥的一線藥物，此外還有一系列心血管保護作用[1-6]。

目前已有采用高效液相色譜（HPLC）-安培法[7]、HPLC-UV法[8]、質(zhì)譜（MS）法[9]、HPLC-電化學檢測法[10]、HPLC-MS法[11]、HPLC-MS/UV法[12-13]、HPLC-安培電流檢測器法[14]和液相色譜（LC）-MS/MS法[15-19]測定吲噠帕胺血藥濃度的報道。由于該藥臨床應用劑量較小，口服后人體血漿或血清中藥物濃度較低，而吲達帕胺與紅細胞的結合率高，全血濃度較血漿濃度、血清濃度更高、更穩(wěn)定[20]。本研究建立一種測定全血中吲達帕胺濃度的UPLC-MS/MS方法，應用于生物等效性預試驗，為吲達帕胺片正式生物等效性試驗提供數(shù)據(jù)參考，并考察受試制劑吲達帕胺片在健康受試者中的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX Triple Quad 5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Allegra X-15R臺式高速冷凍離心機（96孔板，美國貝克曼庫爾特公司）；MDF-U5412N醫(yī)用低溫箱（日本松下公司）；Milli-Q Advantage A10超純水器（美國Millipore公司）；DG-2500R多管漩渦混合儀（上海巴玖實業(yè)有限公司）。數(shù)據(jù)處理軟件：Analyst 1.6.3（美國AB SCIEX公司）；Watson LIMS 7.5 SPS1（美國賽默飛世爾公司）。

1.2 試藥

吲達帕胺對照品（純度97.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；吲達帕胺-d3對照品（化學純度97 %，同位素內(nèi)標純度99.3 %，加拿大TLC公司）；甲醇，乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，美國ACS恩科化學）；N,N-二甲基甲酰胺[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）科技有限公司]，ZnSO4·7H2O（優(yōu)級純，天津科密歐）。受試制劑：吲達帕胺片（規(guī)格：2.5 mg，批號：20171230）；參比制劑：吲達帕胺片[規(guī)格：2.5 mg，批號：968861，法國施維雅藥廠（Les Laboratoires Servier Industrie）]。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

2.1.1 吲達帕胺對照品溶液的配制 取吲達帕胺對照品適量，精密稱定，加N,N-二甲基甲酰胺制成質(zhì)量濃度為 1.0 mg/ml的吲達帕胺對照品儲備液I，于-20 ℃ 冰箱中避光保存。精密移取吲達帕胺對照品儲備液I適量，用50 %甲醇水溶液稀釋并配制成質(zhì)量濃度為 10.0 μg/ml的吲達帕胺對照品溶液。

2.1.2 內(nèi)標（吲達帕胺-d3）溶液的配制 精密稱取吲達帕胺-d3對照品適量，加N,N-二甲基甲酰胺制成質(zhì)量濃度為 1.0 mg/ml的內(nèi)標儲備液I，精密移取內(nèi)標儲備液I適量，用50 %甲醇水溶液稀釋至質(zhì)量濃度為10.0 ng/ml，作為內(nèi)標工作溶液，于-20 ℃冰箱中避光保存。

2.2 樣品預處理

取96孔板，每孔加全血樣品100 μl，再加內(nèi)標溶液（10.0 ng/ml吲達帕胺-d3）50 μl，0.2 mol/l硫酸鋅溶液50 μl，渦旋混合1 min。再加乙腈400 μl，渦旋混合5 min，置4 ℃臺式高速冷凍離心機（96孔板）中，4750 r/min離心10 min ，每孔取上清110 μl，轉移至另一96孔板，每孔加超純水110 μl稀釋，渦旋混合5 min，待測。

2.3 分析條件

2.3.1 UPLC條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex C18（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）；柱溫：40 ℃ ；流動相為 0.1 %甲酸水（A相）和含0.1 %甲酸的甲醇（B相）；梯度洗脫程序見表1。流速：0.5 ml/min；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 MS條件 電離方式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度：550 ℃ ；檢測模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；離子化電壓：5500 V ；入口電壓（EP）：10 V；碰撞室出口電壓（CXP）：13 V。監(jiān)測離子對：吲達帕胺：366.2/132.2，碰撞能量（CE）：19 V，去簇電壓（DP）：100 V；吲達帕胺-d3：369.2/135.2，CE：20 V，DP：140 V。

2.4 試驗設計

篩選12例健康成年受試者，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）在19～26 kg/m2；試驗前病史、體格檢查、心電圖、胸片、實驗室項目及試驗相關各項檢查、檢測均正?；驘o臨床意義的異常；女性受試者為非哺乳期，妊娠試驗檢查陰性；自愿參加本次臨床試驗，理解研究程序且已簽署書面的知情同意書，能按照試驗方案要求完成研究。

采用單中心、空腹、開放、隨機、雙周期、交叉試驗設計，12名受試者隨機分為兩組。第I周期6例受試者口服受試制劑吲達帕胺片2.5 mg，另6例受試者空腹口服參比制劑吲達帕胺片2.5 mg，14 d后交叉給藥進行第II周期研究。兩周期試驗分別于給藥前（0 h）和給藥后 0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0，72.0 h，在黃光條件下采集靜脈全血4 ml，置肝素抗凝管中?；靹虻娜獦悠繁环殖蓛煞?，儲存于超低溫冰箱（冰箱溫度范圍為：≤-60 ℃），用于測定全血中吲達帕胺的血藥濃度。

3 結果與分析

3.1 方法學考察[21]

3.1.1 線性范圍 取空白全血285 μl， 加入不同濃度的吲達帕胺對照品溶液15 μl，使樣品中吲達帕胺的濃度分別為0.200，0.400，4.000，20.000，50.000，120.000，160.000，200.000 ng/ml。按 2.2 項下方法處理樣品，UPLC-MS/MS測定。每個分析批采用雙校正標樣擬合標準曲線，采用Analyst軟件對提取離子色譜圖自動積分，以吲達帕胺與吲達帕胺-d3的色譜峰面積比為縱坐標（y），以全血中分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，ng/ml），采用加權（W=1/X2）最小二乘法，得到標準曲線回歸方程為y=0.242121x+0.001773726（n=5），r2=0.9989，校正標樣回算濃度均在規(guī)定范圍之內(nèi)，說明吲達帕胺在0.200～200.000 ng/ml范圍內(nèi)線性良好，據(jù)此計算得到的藥物濃度準確可靠。本方法的定量下限為標準曲線的最低點0.2000 ng/ml，并滿足信噪比S/N＞10。

3.1.2 殘留 通過在注射定量上限濃度（200.000 ng/ml）樣品后注射空白基質(zhì)樣品（空白全血）來評估殘留。分析物和內(nèi)標經(jīng)色譜分離后，吲達帕胺的保留時間為 1.01 min，吲達帕胺-d3的保留時間為1.01 min，并得到較好的峰形與響應值?？瞻兹獦悠返纳V圖中，分析物和內(nèi)標的色譜峰保留時間附近沒有干擾峰出現(xiàn)，說明該方法的殘留小，對分析物及內(nèi)標的定量均無影響。受試者服用吲達帕胺4 h后的血漿樣品提取離子色譜圖中，吲達帕胺和吲達帕胺-d3的保留時間分別為1.04，1.03 min，表明該方法在用于實際全血樣品測定時保留時間沒有發(fā)生飄移。

3.1.3 精密度與準確度 配制含吲達帕胺定量下限（0.200 ng/ml）和低、低中、中、高（0.600，10.000，80.000，150.000 ng/ml）水平的質(zhì)控樣品各 6份，按 2.2 項下方法進行前處理，在不同天內(nèi)制備并測定3個分析批，考察批內(nèi)、批間準確度和精密度。結果顯示， 5個水平的質(zhì)控樣品批內(nèi)準確度偏差范圍為-6.5 %～4.5 %，批間準確度偏差為-5.5 %～1.0 %，批內(nèi)精密度RSD范圍為0.5 %～3.0 %，批間精密度RSD范圍為0.9 %～3.5 %，見表2。表明該方法精密度、準確度均良好，符合生物樣品定量分析方法驗證指導原則。

表2 準確度與精密度

3.1.4 選擇性、基質(zhì)效應和提取回收率

3.1.4.1 選擇性 采用6批不同供體的空白基質(zhì)制備不添加待測物和內(nèi)標的空白基質(zhì)樣品與定量下限樣品，按 2.2 項下方法進行前處理，進樣分析。本研究6批不同的空白基質(zhì)干擾組分在分析物和內(nèi)標保留時間的響應均為0。表明該方法具有良好的選擇性，能區(qū)分目標分析物和內(nèi)標與基質(zhì)中的內(nèi)源性組分。

3.1.4.2 基質(zhì)效應 將6批來自不同供體的空白基質(zhì)樣品，按2.2項方法處理，向處理后的空白基質(zhì)樣品中分別加入低濃度（LQC）和高濃度（HQC）分析物和內(nèi)標的混合溶液，配制基質(zhì)效應評價樣品，進樣分析，所得分析物和內(nèi)標峰面積與相同理論濃度的純?nèi)芤簶悠返姆治鑫锖蛢?nèi)標峰面積比較，分別考察基質(zhì)效應?；|(zhì)效應用內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)（CV）來評價。基質(zhì)因子為基質(zhì)存在下的峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入吲達帕胺和吲達帕胺-d3測得）與不含基質(zhì)的相應峰面積（由吲達帕胺和吲達帕胺-d3的純?nèi)芤簻y得）比值，計算每批吲達帕胺和吲達帕胺-d3的基質(zhì)因子。進一步通過吲達帕胺的基質(zhì)因子除以吲達帕胺-d3的基質(zhì)因子，計算經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子。由6批空白基質(zhì)計算的內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)均不超過15 %。本研究考察了全血在LQC和HQC下的基質(zhì)效應，結果見表3。結果表明該方法的基質(zhì)效應符合要求。

表3 6批不同來源全血及高脂全血的基質(zhì)效應

3.1.4.3 提取回收率 取空白基質(zhì)，加入分析物和內(nèi)標，按2.2項方法處理，進樣測定；取空白基質(zhì)，按2.2項方法處理，加入分析物和內(nèi)標，進樣測定，比較二者的峰面積均值，考察分析物（低、低中、中、高 4個質(zhì)量濃度）和內(nèi)標的提取回收率。4種濃度分析物的提取回收率分別為101.3 %，99.3 %， 94.5 %，97.9 %，內(nèi)標的提取回收率為98.5 %，說明該方法回收率較高，提取過程不會對結果造成影響。

3.1.5 穩(wěn)定性 用新鮮制備的標準曲線及質(zhì)控樣品，考察不同儲存條件下放置的樣品中吲達帕胺的穩(wěn)定性，分別考察了基質(zhì)樣品（含吲達帕胺的全血樣品）4次凍融循環(huán)穩(wěn)定性、基質(zhì)樣品在室溫放置6 h的穩(wěn)定性、處理過的基質(zhì)樣品自動進樣器溫度條件下放置72 h的穩(wěn)定性及基質(zhì)樣品在冷凍條件下（-80 ℃，-20 ℃）放置70 d的穩(wěn)定性。結果見表4。由表4可見，吲達帕胺基質(zhì)樣品在上述條件下均能保持穩(wěn)定。

表4 不同條件下的穩(wěn)定性考察結果（ ±s，n=3）

表4 不同條件下的穩(wěn)定性考察結果（ ±s，n=3）

濃度水平/ng·ml-1放置后吲達帕胺濃度與放置前濃度比值/%室溫放置6 h自動進樣器溫度下放置72 h長期放置（70 d） 凍融（4次，-80 ℃）-20 ℃ -80 ℃0.600 91.5±3.8 94.7±0.5 94.7±0.9 93.2±2.8 91.2±1.3 150.000 96.7±0.9 96.5±0.3 99.1±1.2 97.9±1.7 97.2±0.3

3.2 吲達帕胺片生物等效性

采用本文建立的UPLC-MS/MS方法測定12名受試者口服受試制劑及參比制劑后的血藥濃度，評價兩制劑之間是否具有生物等效性。以時間為橫坐標、測定的血藥濃度為縱坐標，分別繪制受試制劑及參比制 劑的吲達帕胺平均血藥濃度-時間曲線，見圖1。

圖1 平均血藥濃度-時間曲線

用DAS2.0軟件計算兩種吲達帕胺片劑的藥動學參數(shù)，結果見表5。由血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）計算出受試者的相對生物利用度，結果受試制劑對參比制劑的相對生物利用度為99.5 %±6.2 %。將AUC0-t、AUC0-∞和Cmax經(jīng)對數(shù)轉換后，采用雙向單側t檢驗及（1-2α）置信區(qū)間法評價兩種制劑的生物等效性。受試制劑的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的（1-2α）置信區(qū)間分別為參比制劑相應參數(shù)的 96.0 %～102.7 %、96.0 %～103.1 %、91.2 %～106.3 %，均在80.00 %～125.00 %范圍內(nèi)；AUC0-t、AUC0-∞和Cmax經(jīng)對數(shù)轉換后多因素方差分析結果顯示給藥周期、制劑間、給藥序列間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明本研究中吲達帕胺受試制劑和參比制劑在人體內(nèi)的吸收速度和程度無顯著性差異，具有生物等效性。

表5 受試制劑與參比制劑的主要藥動學參數(shù)比較（n=12）

4 討論

本文應用UPLC-MS/MS技術建立了測定人全血中吲達帕胺含量的方法，進行了完整的方法學驗證，并應用于人體生物等效性預試驗研究。該方法使用乙腈對全血樣品進行蛋白沉淀，操作簡便，有機試劑消耗少；定量下限為 0.2 ng/ml，定量上限為200 ng/ml，該方法可用于吲達帕胺其他劑型不同規(guī)格制劑的血藥濃度檢測，可減少驗證次數(shù)，節(jié)約成本；在流動相選擇方面，選用0.1 %甲酸水和0.1 %甲酸甲醇，可獲得更好的色譜峰型；此外該方法為了減少基質(zhì)效應，蛋白沉淀后取上清，用10 %乙腈水進行1:1稀釋。該方法具有靈敏度高、選擇性好、基質(zhì)效應小等優(yōu)點。在試驗過程中，受試者均未有臨床意義的藥物不良反應出現(xiàn)。本試驗為吲達帕胺片及吲達帕胺緩釋片的生物等效性研究提供了數(shù)據(jù)參考，為正式試驗奠定了基礎。