高效液相色譜法測定土壤中草甘膦的殘留

鄭亞麗 馮小康 朱 強

(蘇州國環(huán)環(huán)境檢測有限公司，江蘇 蘇州 215000)

草甘膦(glyphosate)，又名農達，是世界上應用最多的一種高效、廣譜、低毒的水溶性除草劑，廣泛應用于茶園、果園、甘蔗園等系列農作物的種植中[1-4]。其在農作物中的作用機理主要是通過抑制植物體內5-烯醇丙酮莽草酸-3-膦酸鹽合成酶的活性，干擾植物體內莽草酸的合成[5]。該合成酶存在于芳香族氨基酸生物合成中，而且只有在綠色植物中才能產生，因此草甘膦對綠色植物除草效果明顯。隨著草甘膦使用量的不斷增加，其殘留量嚴重破壞生態(tài)平衡。多項研究表明，土壤中的草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸能夠通過代謝作用進入植物體內污染環(huán)境，并通過食物鏈進行富集傳遞，影響人類食品安全[6]。因此，對土壤中草甘膦的殘留狀況進行監(jiān)測十分重要，研究建立可靠且能在普通實驗室推廣使用的檢測方法尤為關鍵。

目前，國內外草甘膦的檢測方法主要有氣相色譜法[7]，高效液相色譜法[8]，離子色譜法[9-10]，氣相色譜—質譜法[11-13]，液相色譜—質譜法[14-15]等。因草甘膦具有易溶于水，難溶于有機溶劑，揮發(fā)性低，結構中缺少發(fā)色團和熒光團等特點，常規(guī)方法很難直接檢測[16]。為滿足普通實驗室對土壤中草甘膦的殘留檢測，高效液相色譜是最適合的分析方法。同時結合9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-CL)柱前衍生技術，以液液萃取凈化土壤中和衍生化產生的雜質，用具熒光檢測器的液相色譜進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器設備及試劑

Agilent LC 1260，具熒光檢測器 (美國 Agilent 公司)；色譜柱為Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×4.6 mm，4 μm，美國Agilent公司)；Milli-pore純水處理裝置(美國Millipore公司)；DT55高速離心機(北京時代北利離心機有限公司)； ME204電子天平(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-600V 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；THZ-82混勻儀(金壇市科析儀器有限公司)，以及一般實驗室常用儀器和設備。

草甘膦標準品(1 000 mg/L，上海安譜實驗科技股份有限公司)；磷酸(分析純，無錫市晶科化工有限公司)；鹽酸(優(yōu)級純，昆山金城試劑有限公司)；十水合四硼酸鈉(優(yōu)級純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；9-芴甲基氯甲酸酯(優(yōu)級純，Toronto Research Chemicals)；十二水合磷酸鈉(99.99%，阿拉丁)；二水合檸檬酸三鈉(ACS級，上海安譜實驗科技股份有限公司)；乙腈、二氯甲烷、正己烷(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.2 標準曲線的繪制

取一定量的草甘膦標準品，純水定容并配制成10.0、20.0、50.0、100、200、500 μg/L系列混合標準溶液，按1.3.2步驟進行衍生化實驗后，從低濃度到高濃度依次進樣分析。以標準系列溶液中目標化合物濃度為橫坐標，以其對應峰面積為縱坐標建立標準曲線，外標法定量。

1.3 樣品的制備

1.3.1 樣品提取

稱取10 g土壤空白樣品至50 mL離心管中，加入50.0 mL磷酸鈉和檸檬酸鈉混合提取液，超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，上清液用濾紙過濾，得到提取液。提取液用鹽酸溶液調節(jié)pH值至9，靜置10 min后用濾紙過濾，加入50 mL正己烷，充分振蕩后靜置，棄去有機相，水相用50 mL正己烷再萃取一次。

1.3.2 衍生化

取1.00 mL上述凈化后的水溶液于試管中，加入0.12 mL四硼酸鈉溶液和0.20 ml 9-芴甲基氯甲酸酯溶液，密封。常溫下用混勻儀衍生4 h，用針式過濾器過濾后待測。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18 (150 mm×4.6 mm，4 μm)；流動相：A(乙腈)，B(0.2%磷酸水溶液)，梯度洗脫程序如表1所示；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：30 μL；熒光條件：激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長315 nm。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

色譜柱的質量直接影響到樣品組分的分離情況、組分的定性及定量分析。實驗比較了Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱，ZORBAY ODS柱和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱3種液相色譜柱對草甘膦衍生物的分離效果。實驗結果顯示，草甘膦衍生物在ZORBAY ODS柱和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱上分離效果差，響應值低，且峰型較寬，有拖尾；而在Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱子上分離效果最好，且峰形尖銳對稱，色譜圖見圖1。

圖1 不同色譜柱條件下草甘膦衍生物的高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives under different column conditions(A) ZORBAY ODS柱；(B) ZORBAX Eclipse XDB-C18柱；(C) Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱

2.1.2 波長的選擇

不同物質在特定波長下的吸收強度不同，吸收強的響應值就高，反之，響應值小。為了使草甘膦衍生物響應值最高，本實驗分別比較了草甘膦衍生物在波長301 nm和315 nm條件下的響應情況，結果如圖2所示。草甘膦衍生物在波長315 nm條件下峰形良好，響應值很高。故，選擇315 nm作為本實驗發(fā)射波長。

圖2 不同波長條件下草甘膦衍生物的高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives at different wavelengths(A) 301 nm；(B) 315 nm

2.1.3 流速的選擇

流動相的流速對目標物質的分離具有一定的影響。分析了流速為0.5 mL/min和1.0 mL/min時草甘膦衍生物的響應情況，結果顯示在該色譜條件下，流速增大會使草甘膦衍生物峰型變寬，響應強度降低，因此，本實驗選擇0.5 mL/min作為實際分析流量。

圖3 不同流速條件下草甘膦衍生物的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives at different flow rates(A) 0.5 mL/min；(B) 1.0 mL/min

2.2 衍生時間的優(yōu)化

選取1 mL 0.50 mg/L經(jīng)前處理的草甘膦標準溶液進行試驗，常溫條件下按照1.3.2條件分別衍生0.5 h、2 h、4 h、6 h和8 h。觀察在相同的實驗條件和檢測條件下，不同衍生時間對應的樣品測定含量的變化。結果如圖 4 所示，當衍生時間為4 h時，草甘膦衍生物含量最大。因此，衍生時間選擇4 h。

圖4 反應時間對衍生反應的影響Fig. 4 Effects of reaction time onderivatization reaction

2.3 標準曲線和檢出限

按照上述測定草甘膦衍生物的最優(yōu)條件，配制不同質量濃度的草甘膦標準溶液(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L)，以標準系列溶液中目標化合物濃度為橫坐標，以其對應峰面積為縱坐標，建立標準曲線。結果(圖5)表明，草甘膦在0.01～0.50 mg/L范圍內線性關系良好，線性方程為y=1.05x+0.381，R2= 0.999 9。

圖5 草甘膦衍生物標準曲線Fig. 5 Standard curve ofglyphosate derivatives

按照樣品分析的全部步驟，對加標含量為0.05 μg/g 的樣品進行10次平行測定，根據(jù)10次平行測定的標準偏差計算檢出限。

MDL=t(n-1,0.99)×S

式中：MDL——方法檢出限；n——樣品的平行測定次數(shù)；t——自由度為n-1，置信度為99%時的t分布(單側)；當n=10時，根據(jù)t值表查得t(n-1,0.99)=2.821;S——n次平行測定的標準偏差。

計算得出檢出限為0.01 mg/kg。

2.4 準確度和精密度

準確稱取10 g土壤空白樣品，分別添加0.100、0.500和1.00 mg/kg的草甘膦標準溶液，在選定的最佳檢測條件下測定加標回收率及相對標準偏差(RSD)，每個濃度重復6次?？瞻讟悠返闹苽涑瞬患訕耍渌襟E同上。結果如表2所示。

表2 不同添加水平下的平均回收率和相對標準偏差Tab. 2 Average recovery and relative standard deviation at different addition levels

3 結束語

本文通過對濃度為0.100、0.500和1.00 mg/kg的土壤加標樣品進行6次重復測定，得出草甘膦的加標回收率為80.0%～100%；樣品間的相對標準偏差為5.3%～7.8%，檢出限0.01 mg/kg，低于方法標準規(guī)定檢出限(0.02 mg/kg)。該方法實用性強，重現(xiàn)性好，精密度和準確度高，檢出限低，非常適用于土壤、地下水、地表水、生活污水、工業(yè)廢水中草甘膦的檢測。