高糖環(huán)境下GATA4通過調(diào)節(jié)RUNX2影響成骨細胞增殖分化的研究*

陳妍汶，莊利東，陳俊莉，楊 勇

（1.綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，綿陽 621000；2.成都西區(qū)醫(yī)院檢驗科，成都 610031；3.綿陽市中心醫(yī)院紀檢監(jiān)察科，綿陽 621000）

糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis，DOP)是糖尿病在人體骨系統(tǒng)中引起的骨代謝異常性疾病，以骨脆性增加、骨量丟失、骨折風險增加為臨床病理表現(xiàn)[1-2]。DOP進展緩慢、發(fā)病率逐年升高且發(fā)病機制復雜，嚴重危害患者生命健康[3]。成骨細胞為糖尿病狀態(tài)下骨代謝的效應細胞之一，其功能或數(shù)量不足可導致骨形成及骨量減少，在DOP過程中扮演重要角色[4]。故探究高糖條件下成骨細胞增殖分化機制，對DOP的治療具有一定的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，成骨轉錄因子蛋白2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）為成骨細胞分化及骨形成過程中重要的轉錄因子，能激活成骨細胞中堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）及成骨細胞特異性轉錄因子(Osteoblast specific transcription factor，OSX)等基因的轉錄及表達來促進骨形成[5]，且上調(diào)Runx2表達有望成為治療骨質疏松癥的潛在機制[6]。但Runx2 在成骨分化過程的靶向調(diào)控機制還不甚明確。近來有文獻報道，GATA 鋅指轉錄因子蛋白4（GATA zinc finger transcription factor protein 4，GATA4）為成人體內(nèi)的骨形成的關鍵調(diào)節(jié)器，其能直接綁定到Runx2染色質區(qū)域并直接調(diào)控Runx2在正常骨細胞中表達來調(diào)控成骨分化[7]，但又有研究證實，GATA4 能負性調(diào)控Runx2 表達抑制成骨細胞的分化[8]。綜上，GATA4 對Runx2 的靶向調(diào)控作用仍存在爭議，且GATA4 在DOP 中的調(diào)控作還不甚明確。本研究用高糖培養(yǎng)成骨細胞模擬DOP 發(fā)展過程，探究GATA4對DOP成骨細胞增殖、分化的影響及對Runx2的調(diào)控作用，以期闡明DOP成骨細胞增殖分化的其他可能機制，為DOP的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

MC3T3-E1 成骨細胞（購自上海雅吉生物科技有限公司，貨號：YS2905C）；堿性磷酸酶（ALP）活性測定試劑盒（購自南京建成生物工程研究所，貨號：A059）；CCK-8試劑盒（購自上海經(jīng)科化學科技有限公司，貨號：CK04-2）；茜素紅（均購自北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：G8550）；成骨細胞特異性轉錄因子(OSX)、骨唾液蛋白（BSP）蛋白、GATA4、Runx2等抗體（購自美國abcam公司，貨號：ab209484，ab187051，ab84593，ab192256）。RNA 提取試劑盒（購自上海吉至生化科技有限公司，貨號：AR1200-100T）；重組腺病毒（Ad-GFP）、攜帶GATA4 基因的腺病毒載體（Ad-GATA4）、攜帶Runx2-SiRNA 的腺病毒載體（Ad-si-Runx2）均由美國芝加哥大學醫(yī)學中心何通川教授團隊構建并饋贈；酶標儀（購自上海研卉生物科技有限公司，型號：HBS-1096A）；光學顯微鏡（購自日本尼康，型號：E100）。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇與培養(yǎng) 取液氮中凍存的MC3T3-E1細胞，常規(guī)復蘇后，以含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基吹成混懸液；轉入培養(yǎng)瓶中，加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L），在5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)，傳代3 次后取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組及處理 取對數(shù)生長期的MC3T3-E1 細胞以4×107個/L 的密度接種于6 孔板中，毎孔加1 mL 細胞懸液，并按如下條件設置分組：①高糖培養(yǎng)1、4、7、14 d 組，各組均于24 h 貼壁培養(yǎng)后，棄去舊培養(yǎng)基后，分別加入含25 mmol/L葡萄糖[9]培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，收集各組細胞，檢測不同時間點下GATA4、Runx2蛋白的相對表達水平，以確定高糖培養(yǎng)時間；②設置為空白對照組、高糖誘導組、GATA4過表達腺病毒（Ad-GATA4）組、GATA4 空載腺病毒組（Ad-eGFP）組，除空白對照組正常培養(yǎng)不做任何處理外，Ad-GATA4 組及Ad-eGFP 組分別轉染攜帶GATA4過表達的腺病毒及不攜帶GATA4的空腺病毒進行轉染，轉染后均在含25 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d；并用蛋白免疫印跡法（Western blotting）驗證轉染效果，并進行細胞活性及成骨分化檢測。

1.2.3 Western blotting 檢測細胞GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白相對表達水平

取各組細胞，加入400 μL細胞裂解液裂解細胞后，按蛋白提取試劑盒提取總蛋白，按BCA 試劑盒說明書測總蛋白濃度，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳及半干法轉膜反應，聚偏氟乙烯膜封閉2 h后，加入一抗（GATA4、Runx2、OSX、BSP 抗體，稀釋倍數(shù)為1∶1 000，內(nèi)參為GAPDH,稀釋倍數(shù)為1∶1 500），4 ℃下孵育過夜；再加入稀釋3 000 倍的二抗，室溫下孵育1h。再次洗滌條帶3～5次后，加入ECL發(fā)光液，于發(fā)光儀器下曝光、顯影。各組條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值作為目的蛋白GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白的相對表達量。每組試驗重復3次。

1.2.4 CCK-8 法檢測各組細胞存活率情況 取“1.2.3 項”下第二點中培養(yǎng)7d 后的各組細胞后另設空白組（空中只加培養(yǎng)基無MC3T3-E1 細胞），加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育，4 h 后用酶標儀檢測470 nm 波長下的吸光值（OD 值），細胞存活率=（實驗組OD 值-空白組OD 值）/(空白對照組-空白組OD值)×100%。

1.2.5 ALP 染色檢測ALP 活性 收集“1.2.3 項”下第二點中培養(yǎng)7 d后的各組細胞，以4%多聚甲醛固定 30 min，ALP染色30 min后，洗染色液，顯微鏡下觀察拍照。取各組細胞培養(yǎng)液上清液，按ALP活性檢測說明方法，在波長為520 nm 條件下，用分光光度計檢測光吸收值（OD 值），以OD 值大小代表ALP活性水平。

1.2.6 茜素紅染色檢測細胞礦化結節(jié)形成狀況

收集“1.2.3項”下第二點中培養(yǎng)7 d后的各組細胞，以4%多聚甲醛固定，磷酸緩沖溶液洗滌后，1%茜素紅溶液染色15min，磷酸緩沖溶液洗去染色液后，于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 GATA4 過表達腺病毒與Runx2 干擾腺病毒共轉染后細胞GATA4、Runx2 及OSX、BSP 蛋白表達檢測 取對數(shù)MC3T3-E1 細胞，以4×107個/L 的密度接種于6 孔板中，毎孔加1mL 細胞懸液并設置為Ad-GATA4-si-Runx2 組、Ad-GATA4-eGFP2 組、Ad-eGFP-si-Runx2 組、Ad-eGFP-eGFP2 組及未轉染組（高糖誘導組），Ad-GATA4-si-Runx2 組轉染GATA4 過表達腺病毒（Ad-GATA4）及Runx2 干擾腺病毒（Ad-si-Runx2）；Ad-GATA4-eGFP2 組轉染Ad-GATA4 與Runx2 空載體腺病毒（Ad-eGFP2）；AdeGFP-si-Runx2組轉染Ad-eGFP及Ad-si-Runx2；AdeGFP-eGFP2 組轉染Ad-eGFP 及eGFP2；高糖誘導組不做轉染處理；各組均在高糖條件下培養(yǎng)7d后檢測各組細胞GATA4、Runx2 及OSX、BSP 蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。以平均數(shù)±標準差（）表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高糖條件下不同培養(yǎng)時間對細胞GATA4、Runx2蛋白的影響

隨著高糖培養(yǎng)時間延長，細胞中GATA4、Runx2蛋白表達持續(xù)降低，并在7 d 降低至最低水平。與高糖培養(yǎng)1 d組比較，高糖培養(yǎng)4 d、7 d、14 d組細胞GATA4、Runx2 蛋白表達均降低且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與高糖培養(yǎng)4 d 組比較，高糖培養(yǎng)7、14 d 組細胞中GATA4、Runx2 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。高糖培養(yǎng)7 d 與14 d 相比，細胞GATA4、Runx2 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 高糖不同培養(yǎng)時間條件下細胞GATA4、Runx2蛋白表達

2.2 GATA4過表達對細胞存活率影響

與空白對照組比較，高糖誘導組細胞存活率明顯降低（P＜0.05），與高糖組相比，Ad-GATA4 組細胞存活率升高（P＜0.05），Ad-eGFP組與高糖誘導組相比上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 GATA4過表達后各組細胞存活率比較

2.3 GATA4過表達對細胞ALP活性的影響

與空白對照組組比較，高糖誘導組細胞染色變淺，ALP 活性降低（P＜0.05）；與高糖誘導組比較，Ad-GATA4 組細胞染色加深，ALP 活性升高（P＜0.05）；Ad-eGFP組與高糖誘導組相比上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 ALP染色結果與各組細胞ALP活性的比較（標尺：3 mm）

2.4 GATA4過表達對細胞礦化結節(jié)形成的影響

茜素紅染色結果顯示，與空白對照組比較，高糖誘導組細胞染色變淺且礦化結節(jié)減少；與高糖誘導組細胞相比，Ad-GATA4 組細胞染色加深且礦化結節(jié)增多，Ad-eGFP 組與高糖誘導組相比無明顯變化，見圖4。

圖4 茜素紅染色（標尺：3 mm）

2.5 GATA4過表達對細胞中GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白表達的影響

與空白對照組比較，高糖誘導組細胞GATA4、Runx2、OSX、BSP 蛋白表達降低（P＜0.05）；與高糖誘導組相比，Ad-GATA4 組細胞中GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白表達均升高P＜0.05），Ad-eGFP組與高糖誘導組相比上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 各組細胞GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白表達

2.6 共轉染后對細胞GATA4、Runx2 及OSX、BSP蛋白表達的影響

與高糖誘導組相比，Ad-GATA4-eGFP2 組細胞GATA4、Runx2、OSX 及BSP 蛋白表達升高（P＜0.05）；Ad-eGFP-si-Runx2 細胞Runx2、OSX 及BSP蛋白表達降低（P＜0.05），GATA4 蛋白表達變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與Ad-GATA4-eGFP2組比較，Ad-GATA4-si-Runx2 細胞Runx2、OSX 及BSP 蛋白表達降低（P＜0.05），GATA4 蛋白表達變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 各組細胞GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白表達

3 討論

高糖條件可抑制成骨細胞的增殖及分化[10]，高血糖狀態(tài)下，成骨細胞增殖分化障礙是導致DOP發(fā)生發(fā)展的主要原因[11]。Runx2為成骨分化的特異性轉錄因子，陳偉健等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Runx2能通過轉化生長因子-β1(TGF-β1)/骨形態(tài)蛋白（BMP）、果蠅雙翅邊緣缺刻同源基因（Notch）及Wnt 等信號通路來調(diào)節(jié)成骨細胞增殖、凋亡、分化過程，證實Runx2 骨代謝、骨重塑過程扮演不可缺少的角色。王信等[13]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病合并骨丟失患者外周血內(nèi)檢測到Runx2 蛋白表達的異常降低，提示Runx2 丟失可能是骨質疏松癥發(fā)生的重要原因之一。Lee 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Runx2 基因表達可增加卵巢去勢大鼠血清骨密度(BMD)、骨礦物質(BMC)、骨鈣素水平，增加成骨細胞骨礦化能力，并推測上調(diào)Runx2 基因表達對骨質疏松癥的治療有一定的促進作用。本研究在高糖條件下培養(yǎng)成骨細胞1 d、4 d、7 d、14 d后發(fā)現(xiàn)，成骨細胞中Runx2 蛋白表達隨著高糖培養(yǎng)時間的延長逐漸降低并在第7、14 d達到最低水平，進一步證實高糖條件下，成骨細胞Runx2表達降低，可能是導致DOP發(fā)生發(fā)展的危險因子之一。另外，研究證實，除Runx2 外，ALP、OSX 及BSP 也是成骨細胞分化的典型標記基因[14]。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)Runx2基因突變后，可明顯引起ALP、OSX等成骨分化標記基因轉錄表達降低，進而抑制牙槽骨成骨能力，提示成骨分化過程中，Runx2 介導ALP、OSX 及BSP等蛋白表達來促進骨沉積及骨形成。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)成骨細胞7d 后，成骨細胞增殖活性、ALP 活性、礦化結節(jié)形成能力降低的同時，成骨細胞中Runx2蛋白、OSX及BSP蛋白表達異常低于正常對照組，提示高糖抑制成骨細胞增殖分化作用，可能與Runx2及其介導的成骨分化蛋白表達降低有關。

近來研究發(fā)現(xiàn)，GATA4 也與骨代謝及成骨生長、分化關系密切[16-17]。但GATA4 在成骨分化過程中的調(diào)控作用，仍存在爭議：Gao等[18]及Song等[8]發(fā)現(xiàn)抑制GATA4 表達，能夠上調(diào)成骨分化相關表達，促進成骨細胞分化及礦化作用，并減少小鼠骨質溶解，提示GATA4 高表達可抑制成骨分化。然而，趙西博等[19]及Guo 等[20]研究證實促進GATA4 表達，可促進牙周膜干細胞向成骨向分化，而抑制GATA4表達可逆轉牙周膜干細胞向成骨向分化，提示GATA4高表達可促進成骨細胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)，GATA4蛋白表達隨高糖培養(yǎng)時間的延長而降低，且高糖誘導組GATA4蛋白表達顯著低于空白對照組，提示高糖條件可顯著抑制GATA4蛋白表達，而過表達GATA4 后，成骨細胞增殖活性、ALP 活性、礦化結節(jié)形成能力顯著高于高糖誘導組，成骨細胞分化相關基因OSX及BSP蛋白表達也顯著升高，證實了高糖刺激條件下，GATA4 過表達可促進成骨細胞增殖分化，與趙西博等[19]及Guo 等[20]所報道的GATA4 調(diào)控機制一致。另外，GATA4對Runx2的靶向調(diào)控作用研究也存在爭議，Song等[21]發(fā)現(xiàn)GATA4隨著成骨分化時間的遷移表達水平下降，且在原始成骨細胞中過表達GATA4 能夠抑制Dlx5 對Runx2 的作用而進一步抑制成骨分化，提示GATA4可通過抑制Runx2表達，負性調(diào)控成骨細胞分化；而Khalid等[7]研究指出GATA4 是Runx2 的啟動子和增強器，Runx2 轉錄激活依賴于GATA4激活。本研究在GATA4過表達組檢測到Runx2 及其介導的成骨分化相關因子ALP、OSX 及BSP 表達呈增高趨勢，提示GATA4 過表達促進高糖誘導的成骨細胞增殖分化機制可能與其促進Runx2 介導的成骨分化相關基因表達有關。而GATA4過表達的基礎上干擾Runx2，可明顯降低成骨細胞中Runx2蛋白表達及成骨細胞增殖分化活性，提示抑制Runx2 蛋白表達，可逆轉GATA4過表達對高糖條件下成骨細胞增殖分化的促進作用。

綜上所述，高糖可抑制成骨細胞增殖分化，伴隨GATA4、Runx2 蛋白表達降低，過表達GATA4 則可促進成骨細胞在高糖環(huán)境中的增殖、分化，可能與激活Runx2表達有關，為闡明DOP成骨增殖分化功能障礙的可能機制提供了一定的實驗參考。但本研究還存在一定的不足，高糖條件下成骨細胞增殖分化功能障礙的分子生物學調(diào)控機制復雜且途徑較多，GATA4 也可能靶向作用于其他途徑，調(diào)控成骨細胞增殖分化，這有待進一步驗證。