心型脂肪酸結(jié)合蛋白對膿毒癥血管內(nèi)皮細胞損傷的影響*

蔣 文，楊亞東

（1.湖北省黃岡市武穴市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，黃岡 435400；2.湖北省黃岡市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，黃岡 438000）

膿毒癥是燒傷、感染或外科手術(shù)后常見并發(fā)癥，嚴重時可引起急性呼吸窘迫綜合征，是臨床危重病患者死亡的主要原因之一[1]。研究顯示，血管內(nèi)皮細胞損傷在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]，抑制血管內(nèi)皮細胞損傷對膿毒癥的治療尤為重要。心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP），又被稱為脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP-3），屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員，在心、肺和內(nèi)皮細胞中均有表達。有報道稱，H-FABP 在膿毒癥患者血清中的表達明顯高于健康體檢者，且膿毒癥患者存活患者血清中HFABP水平顯高于死亡患者，血清H-FABP水平可作為早期診斷膿毒癥患者心肌損傷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[3]。本研究通過建立LPS（LPS）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）損傷模型，觀察下調(diào)或上調(diào)H-FABP 對LPS 引起的HUVECs 凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥因子表達的影響，以期為抑制或減輕膿毒癥血管內(nèi)皮細胞損傷提供分子治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 HUVECs（上海紀寧實業(yè)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（北京索萊寶）；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invitrogen公司）；H-FABP小干擾RNA（si-H-FABP）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、H-FABP 過表達載體（pcDNA-HFABP）及空載體（pcDNA）（上海生工）；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）；兔抗人cleavedcaspase-9、cleaved-caspase-3、GAPDH 多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天）。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將HUVECs 用含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的HUVECs 接種于6 孔板中（5×105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-H-FABP、si-NC、pcDNA-H-FABP 或pcDNA。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，檢測細胞中H-FABP蛋白表達，并收集細胞備用。

1.3 細胞分組和處理 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的HUVECs 接種于6 孔板中（5×105個/孔），常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h 后，棄培養(yǎng)基。將未轉(zhuǎn)染HUVECs 分為對照組和LPS 組，LPS 組細胞用含100 ng/mL[4]LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，對照組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)染si-H-FABP、si-NC、pcDNA-H-FABP 或pcDNA的HUVECs均用含100 ng/mL LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，并分別記為LPS+si-H-FABP 組、LPS+si-NC 組、LPS+pcDNA-H-FABP 組、LPS+pcDNA 組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞，進行后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 PBS 清洗細胞2次，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL。取1 mL細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進行檢測，流式細胞儀觀察細胞凋亡情況，計算各組細胞凋亡率。

1.5 Western blotting 法檢測H-FABP、cleaved-caspase-9 和cleaved-caspase-3 蛋白表達 RIPA 試劑提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，10%SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉；加入一抗HFABP（1∶500）、cleaved-caspase-9（1∶1 000）、cleaved-caspase-3（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜3 次；二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，洗膜3次；加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光、拍照。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.6 MDA、SOD、LDH、TNF-α和IL-1β水平檢測

用PBS 清洗細胞2 次，加細胞裂解液充分裂解細胞，離心（3 500 r/min、10 min）后，取上清，參照試劑盒說明書，分別檢測細胞上清液中的MDA、SOD、LDH、TNF-α和IL-1β水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對HUVECs中H-FABP蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS 組H-FABP 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 LPS對HUVECs中H-FABP蛋白表達的影響

2.2 下調(diào)或上調(diào)H-FABP 效果驗證與對照組比較，轉(zhuǎn)染si-H-FABP 的HUVECs 中H-FABP 蛋白表達降低（P＜0.05），轉(zhuǎn)染pcDNA-H-FABP 的HUVECs 中H-FABP 蛋白表達升高（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染si-NC 和pcDNA 的HUVECs 中H-FABP 蛋白表達均無明顯變化（P＞0.05），說明下調(diào)或上調(diào)H-FABP 的HUVECs構(gòu)建成功，見圖2。

圖2 下調(diào)或上調(diào)H-FABP效果驗證

2.3 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

與對照組比較，LPS 組HUVECs 凋亡率及cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3蛋白表達升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+si-H-FABP 組HUVECs凋亡率及cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3蛋白表達降低（P＜0.05），LPS+pcDNA-H-FABP組HUVECs 凋亡率及cleaved-caspase-9 和cleaved-caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.05），而LPS+pcDNA 組和LPS+si-NC 組各檢測指標(biāo)均無明顯差異（P＞0.05），見圖3、圖4、表1。

表1 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表1 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡

圖4 Western blotting蛋白電泳圖

2.4 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的影響 與對照組比較，LPS 組LDH 和MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05）。與LPS 組比較，LPS+si-H-FABP 組LDH 和MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 水平升高（P＜0.05）；LPS+pcDNA-HFABP 組LDH 和MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05）；LPS+pcDNA 組和LPS+si-NC 組各檢測指標(biāo)均無明顯差異（P＞0.05），見表2。

表2 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的影響

表2 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的影響

與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

2.5 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs炎性因子表達的影響 與對照組比較，LPS組TNF-α和IL-1β水平升高；與LPS 組比較，LPS+si-H-FABP 組TNF-α 和IL-1β 水平降低（P＜0.05）；LPS+pcDNA-H-FABP 組TNF-α和IL-1β水平升高（P＜0.05）；LPS+pcDNA組和LPS+si-NC 組各檢測指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 H-FABP對LPS誘導(dǎo)的HUVECs炎性因子表達的影響

3 討論

HUVECs 是位于血管內(nèi)壁的一層多功能細胞，處于循環(huán)血液和周圍組織之間，參與維持器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在感染過程中，HUVECs 最先暴露于循環(huán)血液中的侵入性病原體，其在病原體的攻擊下，結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進而引起疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，抑制HUVECs損傷對于感染性疾病的治療十分重要。LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分，其可作為炎性啟動因子促進炎性介質(zhì)的釋放及氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細胞損傷甚至死亡，在膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，常被用作細胞損傷模型的誘導(dǎo)劑[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，HUVECs經(jīng)LPS處理后，凋亡加劇，氧化應(yīng)激水平增加，炎性因子TNF-α和IL-1β表達增加，與相關(guān)報道結(jié)果一致[7]，說明LPS 誘導(dǎo)的HUVECs損傷模型建立成功。

H-FABP是一種可溶性蛋白質(zhì)，含有132個氨基酸，分子量為15 ku。H-FABP 在心肌組織中特性表達，是心肌損傷的標(biāo)志物[8]。心肌細胞凋亡是一種受多種基因分子及信號通路調(diào)控的程序性死亡過程，其中caspases 信號傳導(dǎo)途徑在心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。caspase-9作為caspases信號傳導(dǎo)途徑的啟動分子，在受到上游信號刺激后被活化，形成凋亡復(fù)合體，進而激活下游caspase-3，執(zhí)行細胞凋亡[9]。本研究結(jié)果顯示，LPS促進HUVECs中H-FABP蛋白表達，下調(diào)H-FABP可降低LPS誘導(dǎo)的HUVECs 凋亡及細胞中cleaved-caspase-9 和cleaved-caspase-3蛋白表達，而上調(diào)其表達則發(fā)揮相反的作用，提示H-FABP可能通過激活caspases信號傳導(dǎo)途徑促進LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡。

正常機體內(nèi)，氧化和抗氧化處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而在病理狀態(tài)下，氧化和抗氧化平衡被打破，產(chǎn)生過量氧自由基，進一步損傷機體組織。LDH是一種糖酵解酶，廣泛存在于各種細胞的胞質(zhì)中。細胞受損后，細胞膜通透性增加，細胞培養(yǎng)上清中LDH水平升高，LDH 水平越高，說明細胞受損越嚴重[10]。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，其表達水平越高，可間接說明細胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)越嚴重[11]。SOD 是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，其可清除氧自由基，降低自由基對細胞造成的損傷，其活性升高可提示細胞氧化應(yīng)激水平降低[12]。研究顯示，膿毒癥存活患者血漿SOD水平明顯高于死亡患者[13]，而血漿LDH水平低于死亡患者[14]，為膿毒癥預(yù)后判斷提供了生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)HFABP降低LPS誘導(dǎo)的HUVECs培養(yǎng)上清液中LDH水平及細胞中MDA含量，而提高SOD活性，而上調(diào)其表達則促進LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 培養(yǎng)上清液中LDH 水平及細胞中MDA 含量，而降低SOD 活性，說明H-FABP促進LPS誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激水平，加劇細胞氧化損傷。

炎癥反應(yīng)引起的內(nèi)皮細胞功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理機制。TNF-α 和IL-1β 是常見的促炎因子，其中TNF-α可通過激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，促進IL-1β和IL-6等炎癥介質(zhì)的合成與釋放，引起全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織受損[15]。報道稱，LPS 致膿毒癥大鼠血清TNF-α 和IL-1β 水平明顯增加，五味子乙素可能通過抑制TLR4/NF-κB/MyD88信號通路降低TNF-α和IL-1β的表達對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥起防治作用[16]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)HFABP 可抑制LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 分泌TNF-α 和IL-1β 炎性因子，而上調(diào)其表達則促進LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 分泌TNF-α 和IL-1β，提示H-FABP 可促進膿毒癥血管內(nèi)皮細胞炎性損傷。

綜上，下調(diào)H-FABP 可減少LPS 誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，并降低其氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，而上調(diào)H-FABP 則發(fā)揮相反作用，說明H-FABP 可促進膿毒癥血管內(nèi)皮細胞損傷，其可能是膿毒癥治療的潛在分子靶點。