活血止痛湯對椎間盤退變大鼠髓核細(xì)胞IRE1α/JNK通路的影響*

王安森，李 祥，葉鑫璇，黃美玲，閔水平，謝衛(wèi)勇

（深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院 1.康復(fù)科，2.骨科，深圳 518116）

椎間盤退變是引起慢性腰痛和坐骨神經(jīng)痛的主要原因，可嚴(yán)重影響患者身心健康。普通藥物治療和外科治療不能從根本上緩解疾病，且有復(fù)發(fā)的風(fēng)險，而中醫(yī)藥在該病的預(yù)防和治療方面已有一千多年的歷史[1]。其中，出自《傷科大成》的活血止痛湯，具有活血止痛的功效，主治損傷瘀血、紅腫疼痛，對于治療骨折術(shù)后肢體腫脹疼痛有明顯的效果，可顯著縮短癥狀緩解時間[2]。椎間盤包括髓內(nèi)核和周圍纖維環(huán)，髓核細(xì)胞是駐留在髓內(nèi)核中的主要細(xì)胞類型，負(fù)責(zé)合成膠質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)，維持椎間盤組織穩(wěn)態(tài)。在退化的椎間盤組織中可觀察到炎性細(xì)胞因子水平升高，誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過度凋亡[3]。因此，椎間盤退化與髓核細(xì)胞的炎癥和凋亡有關(guān)，所以通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡可以抑制椎間盤退變[4]。其中，IRE1α/JNK 通路是細(xì)胞凋亡相關(guān)通路，激活結(jié)直腸癌中IRE1α/JNK 通路，可在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。另外，痤瘡丙酸桿菌可通過JNK 通路促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)椎間盤退變[6]。但是活血止痛湯對椎間盤退變大鼠IRE1α/JNK 信號通路及髓核細(xì)胞凋亡的影響，目前尚未見有相關(guān)研究報道。本研究通過構(gòu)建椎間盤退化大鼠模型并使用活血止痛湯干預(yù)該模型，探討活血止痛湯對椎間盤退變大鼠IRE1α/JNK 信號通路及髓核細(xì)胞凋亡的影響，為椎間盤退變患者的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性、8 周齡SPF 級SD 大鼠62只，體質(zhì)量280～290g，購自南方醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（粵）2016-0041。符合國家實(shí)驗(yàn)室動物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定。按照3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道的關(guān)懷照顧。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 活血止痛湯成分為：當(dāng)歸12 g、炒赤芍12 g、陳皮9 g、地鱉蟲12 g、乳香5 g、沒藥5 g、三七9 g、蘇木12 g、川穹6 g、紅花3 g、積雪草6 g、紫荊藤10 g，由深圳中醫(yī)院制劑室統(tǒng)一制備，含量為0.67 g 生藥/mL。尼美舒利分散片（規(guī)格：0.1 g×10片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20020196）購自南昌市飛弘藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 椎間盤退變大鼠模型的建立及分組 參考仇湘中等[7]采用的方法建造椎間盤退變大鼠模型。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，以仰臥位固定四肢，腹部剃毛，碘伏消毒。取右側(cè)旁正中切口，長約2 cm，逐層剖開，將腸管用濕紗布包裹，向頭側(cè)和對側(cè)推移，使腹后壁暴露，剪開腹后膜，保護(hù)好下腔靜脈。以左右骼嵴為定位標(biāo)志，骼嵴平對L6椎體或L5～L6椎間盤，將腰大肌從脊柱附著點(diǎn)上階段性剝離，使L4～L5 和L5～L6 椎間盤暴露。用22G針頭在椎間盤中部進(jìn)行穿刺，使針刺角度與椎間盤矢狀面呈0～60°，并平行于軟骨，穿刺深度約2 mm，停留時間約10 s。穿刺完成后，依次縫合腹膜、筋膜及皮膚（假手術(shù)組僅暴露椎間盤，不進(jìn)行穿刺），并連續(xù)3 d 腹腔注射青霉素20 萬U，以防感染。將大鼠置于25℃左右環(huán)境中，正常飼喂4周，然后造模組和假手術(shù)組各取2只大鼠進(jìn)行椎間盤組織形態(tài)學(xué)觀察，用于驗(yàn)證造模成功[8]。其中造模期間有2只大鼠死亡，均為造模組。共造模成功50只大鼠，使用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，活血止痛湯低、中、高（1.75 g 生藥/kg、2.50 g 生藥/kg、5.00 g 生藥/kg，根據(jù)動物以人等效給藥劑量換算）劑量組和陽性對照組（尼美舒利分散片，0.18 mg/kg[9]），每組10 只，另取10 只假手術(shù)組大鼠。連續(xù)正常飼喂20 d，每天灌胃給藥1 次，給藥體積10 mL/kg，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 HE 染色觀察各組大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化

末次給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉實(shí)施安樂死，切開上述“1.2.1 項”中的原切口，截取L4～L5 腰椎及其間的椎間盤組織，無菌生理鹽水洗去血漬并分組放置，隨機(jī)選取各組部分椎間盤組織迅速置于4%多聚甲醛中固定（剩余部分放入凍存管內(nèi)并置于液氮中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。固定24 h后，使用石蠟包埋，并用切片機(jī)制成4 μm 厚切片，然后參照HE 染色試劑盒說明書依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素染色6 min、分化液分化30 s、伊紅染色2 min、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固后，室溫涼干后，于光學(xué)顯微鏡下觀察椎間盤組織病理變化。

1.2.3 Masuda 評分法對各組大鼠椎間盤組織進(jìn)行病理學(xué)評分

采用王宇鵬等[10]的Masuda評分法對上述“1.2.2項”中各組大鼠椎間盤組織進(jìn)行病理學(xué)評分。

1.2.4 TUNEL 法檢測各組大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞凋亡率

將上述“1.2.2 項”切片二甲苯、乙醇脫蠟、脫水后，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min后，加入蛋白酶K 工作液，37 ℃反應(yīng)30 min 后，PBS 緩沖液洗滌3次，每次5 min。玻片風(fēng)干后，加入TUNEL工作液50 μL，加蓋玻片避光反應(yīng)1 h，PBS 清洗3 次，每次5 min，然后滴加適量2 mg/L DAPI 染液，顏色10 min，自來水沖洗掉多余染液，濾紙吸干，再滴加適量熒光封片液后，置于熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長520～560 nm），每組樣品隨機(jī)選取5 個視野，觀察髓核細(xì)胞凋亡情況，其中紅色熒光細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 ELISA法檢測各組大鼠椎間盤組織中TNF-α和IL-1β含量

取上述“1.2.2 項”中置于液氮中的各組大鼠等質(zhì)量椎間盤組織，使用等量RIPA裂解液裂解，4 ℃，2 500 r/min，離心20 min，取上清，按照TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.6 Western blotting法檢測各組大鼠椎間盤組織IRE1α和JNK蛋白表達(dá)水平

取上述“1.2.2 項”置于液氮中的各組大鼠剩余椎間盤組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉(zhuǎn)PVDF 膜、脫脂奶粉封閉、1∶2 000濃度稀釋后的p-IRE1α、IRE1α、p-JNK、JNK、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，以GAPDH為內(nèi)參，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活血止痛湯對椎間盤退變大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化的影響

假手術(shù)組大鼠椎間盤組織結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)明顯病理變化；模型組大鼠椎間盤組織結(jié)構(gòu)紊亂，髓核基質(zhì)嚴(yán)重凝結(jié)，髓核細(xì)胞明顯減少，且纖維環(huán)嚴(yán)重斷裂；活血止痛湯低、中、高劑量組大鼠椎間盤組織上述病理變化逐漸緩解；活血止痛湯高劑量組與陽性對照組大鼠椎間盤組織上述病理變化差異不明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤組織HE染色圖（400×）

2.2 活血止痛湯對椎間盤退變大鼠椎間盤組織病理評分的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠椎間盤組織病理學(xué)評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，活血止痛湯低、中、高劑量組大鼠椎間盤組織病理學(xué)評分均顯著降低（均P＜0.05）,見表2。

表2 各組大鼠椎間盤組織病理評分比較

表2 各組大鼠椎間盤組織病理評分比較

與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與活血止痛湯低劑量組相比，cP＜0.05；與活血止痛湯中劑量組比較，dP＜0.05。

2.3 活血止痛湯對椎間盤退變大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞凋亡率的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，活血止痛湯低、中、高劑量組大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞凋亡率均顯著降低（均P＜0.05），見圖2和表3。

表3 各組大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞凋亡率比較

表3 各組大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞凋亡率比較

與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與活血止痛湯低劑量組相比，cP＜0.05；與活血止痛湯中劑量組比較，dP＜0.05。

圖2 各組大鼠椎間盤組織中髓核細(xì)胞TUNEL檢測圖（400×）

2.4 活血止痛湯對椎間盤退變大鼠椎間盤組織中TNF-α和IL-1β含量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠椎間盤組織中TNF-α 和IL-1β 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，活血止痛湯低、中、高劑量組大鼠椎間盤組織中TNF-α 和IL-1β 含量均顯著降低（均P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠椎間盤組織中TNF-α和IL-1β含量比較 ng/L,

表4 各組大鼠椎間盤組織中TNF-α和IL-1β含量比較 ng/L,

與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與活血止痛湯低劑量組相比，cP＜0.05；與活血止痛湯中劑量組比較，dP＜0.05。

2.5 活血止痛湯對椎間盤退變大鼠椎間盤組織中IRE1α和JNK蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠椎間盤組織中IRE1α和JNK蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，活血止痛湯低、中、高劑量組大鼠椎間盤組織中IRE1α 和JNK 蛋白磷酸化水平降低，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）,見圖3。

圖3 各組大鼠椎間盤組織IRE1α和JNK蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

在全球范圍內(nèi)，人們普遍認(rèn)為導(dǎo)致腰痛的主要原因是椎間盤退行性變，而椎間盤由內(nèi)髓核構(gòu)成，被纖維環(huán)包圍，髓核細(xì)胞是駐留在髓核內(nèi)的主要細(xì)胞類型，異常刺激可顯著提高髓核中TNF-α和IL-1β水平，誘導(dǎo)椎間盤退變[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變大鼠的椎間盤組織結(jié)構(gòu)紊亂，髓核基質(zhì)嚴(yán)重凝結(jié)，髓核細(xì)胞明顯減少，且纖維環(huán)嚴(yán)重斷裂，其病理學(xué)評分、髓核細(xì)胞凋亡率、TNF-α、IL-1β含量均顯著升高，提示椎間盤退變大鼠髓核細(xì)胞凋亡較多，且伴隨炎癥反應(yīng)。

非手術(shù)治療或保守治療已被證明能有效緩解椎間盤退變，是大多數(shù)患者的第一選擇，所以，中醫(yī)治療方法普遍得到關(guān)注[12]。其中，活血止痛湯主治跌打損傷，淤血腫痛，癥見局部淤血、腫脹疼痛，痛如針刺，因定不移，痛處拒按等，Ju等[13]研究發(fā)現(xiàn)，活血止痛湯的主要藥理作用為鎮(zhèn)痛和抗炎，能夠減輕損傷局部肌纖維的變性，改善骨內(nèi)血流動力學(xué)和血液流變學(xué)狀態(tài)，達(dá)到保護(hù)軟骨、治療骨損傷的目的。克雷氏骨折患者早期使用活血止痛湯加減治療，可顯著減輕疼痛，消除瘀腫，臨床療效明顯[14]。另外，活血止痛湯聯(lián)合中藥熏洗可有效縮短骨折愈合時間，使術(shù)后膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)良好并減少并發(fā)癥的產(chǎn)生[15]，雙極射頻技術(shù)結(jié)合活血止痛湯浴足治療，可緩解跖筋膜炎引起的足跟部疼痛[16]。另外，臨床研究發(fā)現(xiàn)火龍灸結(jié)合加減通督活血湯治療腰椎間盤突出癥效果良顯著[17]，且活血止痛膏對治療腰椎間盤突出癥的臨床療效確切，能有效降低復(fù)發(fā)率和提高患者生活質(zhì)量[18]，其中藥組分主要包括當(dāng)歸、黃芪、赤芍等，與本研究中的活血止痛湯方劑成分相似，推測這幾味中藥對椎間盤退變的治療起主要作用，本研究發(fā)現(xiàn)，活血止痛湯可顯著緩解椎間盤退變大鼠椎間盤組織的病理特征，降低其病理學(xué)評分、髓核細(xì)胞凋亡率、TNF-α、IL-1β 含量，且呈劑量依賴性，提示活血止痛湯可顯著緩解炎癥反應(yīng)，減少髓核細(xì)胞凋亡。

IRE1α/JNK 信號通路涉及多種生化進(jìn)程，包括細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。其中，Cheng 等[19]在高級別漿液性卵巢癌體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，激活I(lǐng)RE1α/JNK通路可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，胞內(nèi)甲基乙二醛也可通過JNK通路誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞發(fā)生炎性損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變大鼠模型的椎間盤組織中IRE1α 和JNK 蛋白磷酸化顯著升高，提示在該模型中IRE1α/JNK 信號通路處于激活狀態(tài)。而Pei 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，重組人腫瘤壞死因子蛋白6 能夠通過抑制髓核細(xì)胞中JNK信號通路，進(jìn)一步抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡，Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)艾塞那肽可通過抑制IRE1a/JNK 通路，保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免受衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，活血止痛湯可顯著降低椎間盤退變大鼠的椎間盤組織中IRE1α和JNK蛋白磷酸化水平，且呈劑量依賴性，提示活血止痛湯可能通過抑制IRE1α/JNK 信號通路，降低椎間盤組織炎癥反應(yīng)，減少髓核細(xì)胞凋亡。

綜上所述，活血止痛湯可能通過抑制IRE1α/JNK信號通路，減輕椎間盤退變大鼠椎間盤組織炎癥反應(yīng)，減少髓核細(xì)胞凋亡，緩解椎間盤病理癥狀。本研究初次探討了活血止痛湯對椎間盤退變的作用機(jī)制，但是其中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，尚需深入研究。