六月青醇提物凝膠劑對大鼠慢性濕疹的作用研究*

陳紅麗，巫小媚，萬杰青，勞永潔，胡曉凡，黃建春

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

濕疹是一種多發(fā)于免疫力低下群體的皮膚炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為皮損和瘙癢反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響疾患人群的身體和心理健康。研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能紊亂是導(dǎo)致濕疹發(fā)生的重要因素[1]，可表現(xiàn)為細(xì)胞免疫和體液免疫的失衡。因此，探尋改善濕疹免疫失衡的方法成為治療該疾病的重要策略。六月青是一種廣西民間草藥，系爵床科植物肖雞籠[Tarphochlamys affinis(Griff.) Bremekhu]的地上干燥部分[2]，《本草拾遺》記載六月青具有消腫、解毒、舒肝瀉濕及行血散瘀等作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，六月青可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IFN-γ 分泌，改善脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能和巨噬細(xì)胞吞噬功能[3-4]，并在免疫調(diào)節(jié)、殺菌、抗?jié)?、減輕炎癥、降低角質(zhì)化程度、軟化瘢痕和抑制濕疹等方面具有一定的功效[5-10]。鑒于六月青在改善免疫機(jī)能方面的功效，結(jié)合濕疹的病因，六月青很可能成為治療濕疹的候選藥物。本研究采用課題組前期制備的六月青凝膠劑治療濕疹模型大鼠，通過觀察皮損、皮膚病理和免疫平衡的變化，探索六月青凝膠劑對慢性濕疹的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 SPF 級SD 大鼠38 只，體重（150 ±20）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2014-0002，實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003。

1.2 藥物與試劑 六月青醇提物凝膠劑由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗室制備，制備方法：六月青干燥莖葉用乙醇回流提取法提取得到六月青醇提物浸膏，再分別按照處方量加入甘油、卡波姆和吐溫-80，充分混勻，充分膨脹后再用適量三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至7 左右即得?？匪崮姿赡z（華潤三九藥業(yè)有限公司，批號：1907003J）；2，4-二硝基氯苯（DNCB，成都愛科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，批號：201906281）。白細(xì)胞介素-4（IL-4）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191217）；干擾素-γ（IFN-γ）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191217）。

1.3 濕疹模型的建立 將38只大鼠隨機(jī)分為空白組（6 只）和模型組（32 只），在模型組大鼠背部皮膚A 處（2 cm×2 cm)和B 處（4 cm×4 cm）脫毛。24 h后，量取100 μL 7%2，4-二硝基氯苯丙酮溶液在大鼠皮膚A 處致敏，不久可觀察到大鼠劇烈瘙癢，多次出現(xiàn)打滾、搔抓行為。5 d后，量取200 μL 0.7%二硝基氯苯丙酮溶液在皮膚B 處激發(fā)。每隔3 d 激發(fā)1次，累計激發(fā)8次，B處皮膚漸漸可觀察到紅斑、豆疹、抓痕、脫屑等現(xiàn)象，對每次激發(fā)后皮損情況進(jìn)行評分和分析[11]?？瞻捉M只在A、B兩處脫毛，不做其他處理。

1.4 分組及給藥 激發(fā)結(jié)束后，隨機(jī)選取2只模型組大鼠，處死，取B 處皮膚進(jìn)行蘇木精—伊紅（HE）染色并觀察組織病理變化，發(fā)現(xiàn)表皮增厚粗糙，角化過度，炎細(xì)胞浸潤的濕疹病理即顯示造模成功，再將成模大鼠隨機(jī)分為5 組：模型組、陽性組、六月青醇提物凝膠劑高、中、低劑量組，每組6 只。停止激發(fā)的第2 天，分別于大鼠B 處皮膚涂抹給予相應(yīng)藥物。模型組每只涂抹空白凝膠0.5 g，陽性組每只涂抹糠酸莫米松凝膠0.2 g，六月青醇提物凝膠劑高、中、低劑量組分別每只涂1.5 g、1.0 g、0.5 g，2次/d，連續(xù)給藥10 d?？瞻捉M不做處理。

1.5 皮損評分 每次給藥前、后觀察造模處皮膚狀況，以紅斑程度、水腫或丘疹、表皮剝脫或抓痕程度、傷口有無滲出或滲出后結(jié)痂程度、角質(zhì)層苔蘚樣變程度進(jìn)行皮損評分。0分為無癥狀，3分為上述癥狀十分明顯，分值以0.5為單位增加[12]。

1.6 皮膚組織病理學(xué)觀察 最后1次給藥24 h后，麻醉大鼠，腹主動脈采血，采血結(jié)束后，取B處皮膚組織用4%甲醛固定，行HE 染色，顯微鏡下觀察皮膚組織病理學(xué)變化。

1.7 血清IL-4、IFN-γ含量和IFN-γ/IL-4的檢測

取大鼠血液進(jìn)行離心，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清中IL-4 和IFN-γ含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠皮損評分結(jié)果 給藥前，5組均有紅斑、丘疹、抓痕/剝脫的現(xiàn)象出現(xiàn)，皮損評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，陽性組皮損評分在第2 天后下降（P＜0.05），六月青醇提物凝膠高劑量組皮損評分在第4 天后下降（P＜0.05）；與模型組比較，六月青醇提物凝膠中、低劑量組皮損評分在第8天后降低（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 六月青醇提物凝膠劑對皮損評分的影響 分，，n=6

表1 六月青醇提物凝膠劑對皮損評分的影響 分，，n=6

與模型組比較，*P＜0.05。

圖1 六月青醇提物凝膠對皮損的影響

2.2 組織病理學(xué)觀察 HE 染色結(jié)果顯示，空白組大鼠皮膚角質(zhì)層正常，無水腫，無炎性細(xì)胞浸潤等病理改變。模型組大鼠皮膚出現(xiàn)表皮增厚粗糙、角化過度、炎性細(xì)胞浸潤的濕疹病理表現(xiàn)。各組采用相應(yīng)的藥物治療10 d 后，陽性組、六月青醇提物凝膠高、中、低劑量組動物表皮層比較較薄，角化程度較輕，濕疹病理表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，見圖2。

圖2 六月青醇提物凝膠組的皮膚組織病理圖片（HE染色，×400）

2.3 6組血清中IL-4、IFN-γ含量和IFN-γ/IL-4比較 與空白組比較，模型組IL-4 顯著升高（P＜0.05），IFN-γ 及IFN-γ/ IL-4 顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組的IL-4 顯著降低（P＜0.05），IFN-γ 及IFN-γ/IL-4 顯著升高（P＜0.05），六月青醇提物凝膠劑高、中、低劑量組大鼠IL-4 無明顯變化（P＞0.05），而IFN-γ 及IFN-γ/ IL-4 顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 6組大鼠血清IFN-γ、IL-4含量和IFN-γ/IL-4比較 ，n=6

表2 6組大鼠血清IFN-γ、IL-4含量和IFN-γ/IL-4比較 ，n=6

與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3 討論

濕疹是臨床常見表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚科疾病，世界范圍內(nèi)有數(shù)百萬人患有或曾經(jīng)患有濕疹，濕疹不僅影響患者身心健康，且增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)。濕疹的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無特效治療藥物。在濕疹發(fā)生的早期階段，臨床表現(xiàn)為紅斑、丘疹和小水泡等，嚴(yán)重時出現(xiàn)滲出或者糜爛。組織病理學(xué)多表現(xiàn)為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)的破壞。目前，認(rèn)為皮膚屏障功能障礙是濕疹發(fā)病的關(guān)鍵[13]。因此，抑制濕疹早期階段表皮炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及保護(hù)皮膚的屏障功能至關(guān)重要。中藥六月青富含皂苷類成分，具有抗炎以及促進(jìn)表皮細(xì)胞生長等藥理活性，為驗證其對濕疹的療效，本研究通過用2，4-二硝基氯苯對大鼠進(jìn)行濕疹造模，經(jīng)六月青醇提物凝膠涂抹給藥10 d 后，發(fā)現(xiàn)皮膚紅斑改善明顯。此外，濕疹模型大鼠皮膚切片顯示炎性細(xì)胞程彌漫狀浸潤、細(xì)胞有水腫等現(xiàn)象，經(jīng)六月青醇提物凝膠劑治療后，大鼠炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞間水腫的現(xiàn)象減輕，皮膚角質(zhì)層顯著改善。提示六月青醇提物凝膠劑可通過改善濕疹早期皮膚表皮炎癥的發(fā)生，保護(hù)皮膚的屏障功能，減緩濕疹的病情發(fā)展。

濕疹是由內(nèi)外致敏因子引起的疾病，致敏T 細(xì)胞激活Th2免疫應(yīng)答，釋放IFN-γ、IL-4等炎癥因子，造成組織損傷。在濕疹病理過程中IFN-γ和IL-4的含量水平能反映這兩個Th1、Th2 細(xì)胞免疫應(yīng)答參與程度，IFN-γ 和IL-4 在免疫應(yīng)答中相互調(diào)節(jié)形成動態(tài)平衡[14-15]。本研究結(jié)果顯示，濕疹模型組大鼠IL-4 升高、IFN-γ 降低，IFN-γ/IL-4 比值降低，出現(xiàn)Th1/Th2 失衡。給予六月青醇提物凝膠劑治療后，六月青醇提物膠劑高、中、低量組IFN-γ 和IFN-γ/IL-4 比值較模型組顯著增大，六月青醇提物凝膠劑中劑量組在均值水平上增加IFN-γ的效果優(yōu)于高劑量組，可能由于涂抹過厚，不易于經(jīng)皮吸收，六月青醇提物凝膠劑的劑量和效應(yīng)關(guān)系還需深入研究。但從治療效果來看，高、中、低劑量均可顯著矯正濕疹模型大鼠Th1/Th2的失衡。從濕疹發(fā)病的細(xì)胞分子機(jī)制來看，六月青醇提物可通過改善機(jī)體免疫失衡，上調(diào)IFN-γ的表達(dá)，其機(jī)制可能是六月青醇提物在Th0 細(xì)胞分化過程中影響細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)Th0向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)IFN-γ的分泌，而減弱IL-4的表達(dá)。提示六月青醇提物凝膠劑可以通過抑制致敏因子的生成，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，減緩濕疹的病情發(fā)展。

綜上所述，六月青醇提物凝膠劑可明顯改善濕疹早期皮膚表皮炎癥反應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)濕疹大鼠的皮膚屏障，改善濕疹的病理變化；并通過上調(diào)大鼠血清中IFN-γ 水平、矯正Th1/Th2 的免疫失衡，抑制致敏因子的生成，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，減緩濕疹的病情發(fā)展。