白藜蘆醇對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4細(xì)胞惡性生物學(xué)特征及PI3K/Akt信號(hào)通路影響*

劉衛(wèi)國，張 情，侯俊杰，劉 泉，何育威，何利芳Δ

（1.長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院甲乳外科，仙桃 433000；2.黃石市中心醫(yī)院甲乳外科，黃石 435000）

甲狀腺乳頭狀癌約占所有甲狀腺癌的80%，是甲狀腺最常見的惡性腫瘤甲狀腺[1]。據(jù)研究報(bào)道，甲狀腺乳頭狀癌的年發(fā)病率正顯著上升[2-3]。雖然甲狀腺乳頭狀癌惡性程度不高，但由于其發(fā)病隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，且與甲狀腺良性結(jié)節(jié)比較相似，不易鑒別，容易導(dǎo)致頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而錯(cuò)過最佳治療時(shí)間，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[4]。目前對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌的治療以手術(shù)、化療和放療等方式為主。此外，積極情緒可以改善甲狀腺癌患者的癌因性疲乏，從而影響患者的預(yù)后[5]。雖然這些醫(yī)療手段對(duì)該疾病具有一定的改善作用，但部分患者對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性影響了患者的預(yù)后，所以在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生轉(zhuǎn)移之前尋求新的藥物尤為重要。白藜蘆醇是一種天然的多酚類物質(zhì)，具有多種藥理活性，包括抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化應(yīng)激以及降血脂等[6]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，白藜蘆醇可以在多種癌癥中發(fā)揮抗癌功效，如乳腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌等[7]。Yuan 等[8]研究報(bào)道白藜蘆醇通過AKT/GSK-3beta/Snail信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wu等[9]通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制THJ-16T 和THJ-21T 細(xì)胞增殖，從而在間變性甲狀腺癌中發(fā)揮療效。董成龍等[10]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但對(duì)于白藜蘆醇在甲狀腺乳頭狀癌中是如何發(fā)揮抗癌作用的，其具體機(jī)制尚無定論。因此，本研究探究了白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)特征的影響以及其作用機(jī)制，以期為甲狀腺乳頭狀癌的臨床治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要細(xì)胞、藥物及試劑

白藜蘆醇（貨號(hào)：501-36-0）購自蓋德化工網(wǎng)；人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4細(xì)胞株購自上海傳秋生物科技有限公司；LY294002 抑制劑（貨號(hào)：934389-88-5）和四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazo-lium，MTT；貨號(hào)：13183-79-4）均購自Sigma-Aldlrich公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI；貨號(hào)：25535-16-4)購自上海源葉生物；DMEM 培養(yǎng)液（貨號(hào)：D6046）購自Worldrm 生物商城；RPMI-1640 培養(yǎng)基（貨號(hào)：BC-B-021）和胎牛血清(貨號(hào)：JLAQ-110)購自鄭州九龍生物公司；青霉素（貨號(hào)：BC-CE-012）購自南京生航生物技術(shù)有限公司；鏈霉素（貨號(hào)：57-92-1）購自上海穎心實(shí)驗(yàn)室；胰酶（貨號(hào)：8049-47-6）購自ChemicalBook公司；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒（貨 號(hào)：PRTD1) 購 自Cyanagen Srl 公 司；MatrigelTM 底膜基質(zhì)(貨號(hào)：354230)購自上海索寶生物科技有限公司；Bax 抗體（貨號(hào)sc-7480）、抗體Bcl-2（貨號(hào)：sc-7382）、PI3K抗體（貨號(hào)：sc-365290）、Akt 抗體（貨號(hào)：sc-5298）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GADPH；貨號(hào)：51332）和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自Santa Cruz公司；Caspase-3抗體(貨號(hào)：9662）均購自CST 公司；T-AOC 試劑盒（貨號(hào)：E-BC-K225-M）購自Elabscience公司；Transwell小室北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；人工基底膜（貨號(hào)：354234）購自北京盈豐大通科技有限公司；PBS 溶液(貨號(hào)：D8537）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-GFP/PI 雙染試劑盒（貨號(hào)：FY600016-20T）購自弗元生物科技有限公司；

1.2 儀器

Being BPN-RHP CO2培養(yǎng)箱購自集思儀器；EPS-300 電泳儀購自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；JS-680D 凝膠成像儀購自杭州得聚儀器設(shè)備公司；1703940 半干電轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；BDF-25V270 低溫冰箱購自博科公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；MH-2 型微型振蕩儀購自北京銘成基業(yè)科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將IHH4 細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640 培養(yǎng)基中，其中添加了10%胎牛血清以及100 U/mL 的青霉素和鏈霉素。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到75%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.4 細(xì)胞分組

先用RPMI 1640 培養(yǎng)基將白藜蘆醇進(jìn)行稀釋，使其濃度變?yōu)?5 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L。再將IHH4 細(xì)胞進(jìn)行如下分組：不經(jīng)白藜蘆醇藥物處理的作為對(duì)照組，經(jīng)25 μmol/L 藥物處理的作為低劑量組，經(jīng)50μmol/L藥物處理的作為中劑量組，100μmol/L 藥物處理的作為高劑量組，經(jīng)50μmol/L LY294002 PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制劑處理的作為抑制劑組。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期的IHH4細(xì)胞，接種于96孔板上，使細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，培養(yǎng)1 d后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入各藥物處理，分別向各孔加入100μL對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。接種結(jié)束后在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，去除上清液，用培養(yǎng)液沖洗3 次以去掉藥液。然后加入50 μL(1 mg/mL)的MTT 溶液，培養(yǎng)4 h 后，再加入二甲基亞砜(150μL/孔)使沉淀溶解，然后用微型振蕩儀振蕩12 min，在490 nm 波長下，通過酶標(biāo)儀測(cè)出每孔吸光度(opticaldensity，OD)值，取3 孔計(jì)算平均OD值。將不加任何細(xì)胞的一孔作為空白，無藥血清作為對(duì)照組，從而計(jì)算出細(xì)胞生長抑制率%，計(jì)算公式：增殖抑制率（%）=(1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

用Transwell 法檢測(cè)IHH4 細(xì)胞的侵襲能力。IHH4 細(xì)胞在100μL 含血清的DMEM 中培養(yǎng)，將細(xì)胞置于含有Transwell 預(yù)涂的基質(zhì)凝膠膜過濾器的上腔內(nèi)，在24 孔板培養(yǎng)板上插8 μm 孔。培養(yǎng)48 h后，用棉簽去除上膜上殘留的細(xì)胞。侵襲細(xì)胞膜的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。隨機(jī)選取5 個(gè)視野在100 倍顯微鏡下觀察，侵襲細(xì)胞數(shù)用Adobe Photoshop CS6 計(jì)數(shù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

1.7 細(xì)胞流式術(shù)

采用胰酶將對(duì)數(shù)生長期的IHH4細(xì)胞進(jìn)行消化以調(diào)整其密度，然后將IHH4細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板中（4×103個(gè)/孔）。按照實(shí)驗(yàn)分組加入各藥物處理，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，消化細(xì)胞后加入100μL二甲基亞砜、20 μL AnnexinV-FITC及和20μL PI染液，混勻后于37℃下避光反應(yīng)20 min，在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。在消化后細(xì)胞內(nèi)加入70%乙醇溶液固定1 h，PBS溶液清洗細(xì)胞后加入PI進(jìn)行染色重懸，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K 和Akt 蛋白的表達(dá)量。取對(duì)數(shù)生長期IHH4 細(xì)胞，進(jìn)行消化使其密度為1×105個(gè)/mL，然后通過6孔板進(jìn)行接種。按照實(shí)驗(yàn)分組加入各藥物處理，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，吸去培養(yǎng)液，用3 mL 預(yù)冷PBS 洗滌3 次，然后在SDS 樣品緩沖液中煮沸。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，半干法轉(zhuǎn)到PVDF 膜，然后用5%脫脂奶粉，在37 ℃搖床中封閉1 h。將膜與Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K 和Akt（1:1 000）的一抗在4 ℃下過夜。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:10 000）作為二抗，加入二抗在37 °C 環(huán)境中培養(yǎng)1 h，顯色成像并通過Image-ProPlus 軟件對(duì)圖片條帶進(jìn)行灰度值分析，以GADPH（1:1 000）作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各蛋白的相對(duì)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制IHH4細(xì)胞的增殖能力

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增大。同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組和抑制劑組中IHH4 細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高；且劑量越高，對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制效果越顯著（P＜0.05），相比高劑量組，抑制劑組中IHH4 細(xì)胞的增殖抑制率無顯著改變（P＞0.05），見圖1，表1。

表1 各組IHH4細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果比較 ，%，n=3

表1 各組IHH4細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果比較 ，%，n=3

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

圖1 白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 白藜蘆醇抑制IHH4細(xì)胞的侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（250.45±18.63）個(gè)、低劑量組為（180.64±16.15）個(gè)，中劑量組為（140.01±12.82）個(gè)，高劑量組為（93.43±7.64）個(gè)以及抑制劑組為（91.03±5.25）個(gè)（F=77.782，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組以及抑制劑組的穿膜細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)出不同程度的減少，且隨白藜蘆醇劑量逐漸增高，穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲數(shù)

2.3 白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞凋亡及周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞的凋亡及周期的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組和抑制劑組均可有效的促進(jìn)IHH4 細(xì)胞的凋亡，致使細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1 期阻滯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2，圖3。

表2 各組IHH4細(xì)胞的凋亡及周期情況 ，%，n=3

表2 各組IHH4細(xì)胞的凋亡及周期情況 ，%，n=3

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

圖3 IHH4細(xì)胞凋亡染色圖

2.4 白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組以及抑制劑組中的Bax 和Caspase-3 蛋白水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2 的蛋白水平顯著下調(diào)(P＜0.05）；劑量越高，效果越顯著(P＜0.05)，見圖4，表3。

圖4 白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞凋亡蛋白水平的影響

表3 各組凋亡蛋白水平比較 ，n=3

表3 各組凋亡蛋白水平比較 ，n=3

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

2.5 白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

蛋白印跡法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組以及抑制劑組中PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05)，劑量越高，效果越顯著(P＜0.05)，見圖5，表4。

圖5 白藜蘆醇對(duì)IHH4細(xì)胞通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 各組通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果比較 ，n=3

表4 各組通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果比較 ，n=3

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與低劑量組相比，#P＜0.05；與中劑量組相比，&P＜0.05。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤之一，由于其生長和轉(zhuǎn)移速度較快，容易頻繁復(fù)發(fā)，影響患者的預(yù)后[11]。因此，在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生轉(zhuǎn)移之前尋求新的藥物已成為治療甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)鍵。白藜蘆醇作為一種多酚類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)血脂代謝等多種生物活性。鑒于近幾年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在癌癥進(jìn)展的主要階段中均具有抗癌活性，是目前公認(rèn)最有潛力的天然抗癌藥物之一[12-13]。

癌細(xì)胞增殖、侵襲是導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，腫瘤惡化的特征。凌科技等[14]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力，發(fā)揮抗癌作用。在本研究中，通過MTT 實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制甲狀腺乳頭狀癌IHH4細(xì)胞的增殖和侵襲能力，且隨著白藜蘆醇劑量的增加而增強(qiáng)。此外，高劑量的白藜蘆醇和PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑對(duì)IHH4細(xì)胞的增殖和侵襲能力的抑制程度無顯著差異。PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡、能動(dòng)性、侵襲和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，并在腫瘤的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[15]。當(dāng)生長因子將PI3K 激活后，激活的PI3K使細(xì)胞膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇變?yōu)?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，然后，磷酸肌醇依賴的蛋白激酶激活A(yù)kt，活化的Akt 使GSK-3、caspase-9 等蛋白磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[16]。當(dāng)PI3K/Akt 信號(hào)通路被激活后，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Snail、Twist、ZEB等核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)的鈣粘附蛋白E 的水平，而當(dāng)鈣粘附蛋白E降低后，細(xì)胞黏附能力會(huì)下降，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力也隨之增強(qiáng)[17]。以上結(jié)果提示，白藜蘆醇可抑制IHH4 細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可能與PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制有關(guān)。

凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，能有序和有效地去除受損細(xì)胞，與很多疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，包括癌癥[18]。已有相關(guān)研究表明，白藜蘆醇可促進(jìn)多種癌細(xì)胞的凋亡，包括甲狀腺癌[19-21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白藜蘆醇和抑制劑處理后甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4 細(xì)胞的凋亡率顯著升高。Bax，caspase 3，Bcl-2作為經(jīng)典的凋亡蛋白，其中Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)，二者可結(jié)合成異質(zhì)二聚體而失活，而當(dāng)二者的相對(duì)表達(dá)量失衡時(shí)，可破壞線粒體膜的完整性，最終激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡進(jìn)程的改變[22]。在凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)IHH4 細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇和抑制劑干預(yù)后Bax和Caspase-3蛋白水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白水平明顯下調(diào)。有研究顯示，當(dāng)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的凋亡[23]。這些論據(jù)說明白藜蘆醇能促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)凋亡終末效應(yīng)因子Caspase-3 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生長。失控性生長是腫瘤惡化的特征，主要是因?yàn)榧?xì)胞周期發(fā)生紊亂。本研究經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和抑制劑可以有效地促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH4 細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1 期阻滯。研究顯示，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路可使人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞阻滯于G1 期[24]，而細(xì)胞從G1 向S 期的轉(zhuǎn)化是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵限速步驟之一，因此推斷，IHH4 細(xì)胞發(fā)生周期延長或阻滯，使得DNA 合成受阻，抑制細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。既往研究表明，白藜蘆醇通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路從而抑制肺癌細(xì)胞的活力，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)白藜蘆醇和抑制劑處理后細(xì)胞中PI3K、Akt 蛋白表達(dá)下降，因此推斷，白藜蘆醇促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)。關(guān)于白藜蘆醇在甲狀腺乳頭狀癌中的療效以及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索與證實(shí)。

綜上所述，白藜蘆醇抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖和侵襲，影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。