甘蔗葉多糖對(duì)大鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響*

劉 丹，林 錕，侯小濤，何 濤Δ

（1.湖南省人民醫(yī)院星沙院區(qū)，長(zhǎng)沙 410000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

心肌梗死是一種臨床常見危重癥，具有高致殘率和致死率。心肌梗死后心肌纖維化是心肌組織對(duì)缺血刺激產(chǎn)生的一種自我修復(fù)的過程[1]。在心肌梗死早期可形成瘢痕，防止心臟破裂，但后期隨著細(xì)胞外基質(zhì)過度蓄積，無收縮功能的瘢痕組織替代受損的心肌，心室順應(yīng)性下降[2]，最終發(fā)展為心力衰竭。因此，如何有效減輕心肌間質(zhì)纖維化是防治心肌梗死后心衰的重要策略。有研究顯示，心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展受多種基因及蛋白的調(diào)控，其中細(xì)胞因子TGF-β1、NF-κB 及ERK1/2 與心肌纖維化密切相關(guān)[3-4]，其在刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成、促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白等效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗葉多糖能促進(jìn)梗死區(qū)周圍心肌組織的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)[6]，對(duì)缺血心肌有一定的保護(hù)作用。此外，甘蔗葉多糖藥效研究顯示，其具有抗炎、抗氧化、抗自由基等作用[7]，能減輕炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。為明確甘蔗葉多糖能否減輕大鼠心肌梗死后心肌纖維化，本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌梗死模型，檢測(cè)心肌梗死后心肌纖維化的程度及上述相關(guān)因子的表達(dá)，探討甘蔗葉多糖對(duì)大鼠心肌梗死后心肌纖維化可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性8周齡SD大鼠26只，體重(230±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(桂）2014-0002。

1.2 材料和試劑 甘蔗葉多糖（廣西中醫(yī)藥大學(xué)侯小濤老師課題組提供）；Ⅰ型膠原抗體（博奧森公司，bs-0578R）；Ⅲ型膠原抗體（博奧森公司，bs-0549R）；通用SP試劑盒（北京中杉橋生物技術(shù)有限公司）；Trizol Reagent（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物，RR036A；熒光定量試劑盒（大連寶生物，RR820A）；引物合成（上海生工）；磷酸酶抑制（Roche 公司）；一抗、二抗稀釋液（武漢博士德公司，AR1017）；兔一抗p44/42 MAPK(ERK1/2)（美國(guó)CST 公司）；兔一抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)（美國(guó)CST 公司）；兔一抗GAPDH（美國(guó)CST 公司）；二抗羊抗兔IgG（英國(guó)Abcam，ab97051）。

1.3 主要儀器 動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾特生物科技有限公司，ALC-V9）；心電圖機(jī)（日本福田公司，F(xiàn)CP-2155）；PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad，CFX connect）；ECL 化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)ProteinSimple，F(xiàn)liorChem HD2）；超聲波細(xì)胞破碎儀（美國(guó)SONICS）；蛋白印跡電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad）；正置熒光顯微鏡（OLYMPUS，BX53）。

1.4 大鼠心梗模型的制備、分組及給藥 26只健康SD 大鼠參照文獻(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備大鼠心肌梗死模型[8]。結(jié)扎前后分別記錄心電圖，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎后肢導(dǎo)ST段較結(jié)扎前抬高。將造模成功后大鼠隨機(jī)分為模型組（MI 組）、處理組（SLP組），另設(shè)假手術(shù)組（Sham組），Sham組只穿線未予結(jié)扎。造模后第1 天開始，各組分別進(jìn)行灌胃處理，SLP組灌入甘蔗葉多糖溶液（4 g/L），按1 mL/100 g 大鼠體重給藥，MI 組及Sham 組灌入等量的0.9%生理鹽水，連續(xù)4周。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)NF-κB、TGF-β1 mRNA 表達(dá) 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區(qū)組織中，取50 mg 左右梗死周邊區(qū)心肌組織，剪碎、超聲勻漿后采用Trizol 法提取RNA，經(jīng)PrimeScriptTMRT Master 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Ta-KaRa SYBR ExScript RT-PCR Kit 進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，GAPDH 為相對(duì)定量參照物，2-△△CT計(jì)算基因表達(dá)水平。GAPDH 上游序列：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游：5'-G ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TGF-β1 上游序列：5'-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3'，下游：5'-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3'；NF-κB 上游序列：5'-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3'，下游：5'-TCCGGAACACAATGG CCAC-3'。

1.6 Western blotting檢測(cè)p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達(dá) 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區(qū)組織中，取50 mg左右梗死周邊區(qū)心肌組織，剪碎后經(jīng)超聲勻漿破碎后提取蛋白。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗(GAPDH、ERK、p-ERK均為1∶1 000)、二抗（1∶5 000）、ECL 化學(xué)發(fā)光底物顯色后，使用FliorChem HD2 成像系統(tǒng)（ProteinSimple）觀察，DRAFT-alphaview 計(jì)算圖像條帶灰度值，計(jì)算P-ERK1/2/ERK1/2 蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.7 大鼠心肌結(jié)締組織染色 取梗死周邊區(qū)心肌組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋制成切片，光學(xué)顯微鏡下觀察，Masson染色檢測(cè)梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)纖維化的程度，正常的心肌纖維被染成紅色，纖維化的膠原纖維被染成藍(lán)色，細(xì)胞核則染成黑藍(lán)色，纖維化程度用膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)（CVF=膠原面積/所測(cè)視野面積）表示。免疫組化觀察梗死周邊區(qū)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)情況，陽性為梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)著色棕色或棕黃色的片狀區(qū)域，陽性反應(yīng)強(qiáng)度用MIOD（MIOD=IOD/AOI）表示，陽性反應(yīng)強(qiáng)度與Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系。每張切片在10×40倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image-pro plus 6.0 軟件分別計(jì)算每張切片的CVF、MIOD。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 與SNK 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，多組間均數(shù)比較則采用Welch 分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區(qū)NF-κB、TGF-β1mRNA 和p-ERK1/2/ ERK1/2 的表達(dá) 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區(qū)TGF-β1、NF-κB mRNA 和p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白均表達(dá)。與Sham組相比，MI 組TGF-β1、NF-κB mRNA 表達(dá)明顯增加，而SLP組中TGF-β1、NF-κB mRNA表達(dá)較MI組顯著降低（均P＜0.05）。與Sham 組相比，MI 組、SLP 組中p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表達(dá)顯著增加，而SLP 組中p-ERK1/2/ERK1/2 較MI 組表達(dá)明顯降低（均P＜0.05），見表1，圖1。

表1 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)組織TGF-β1、NF-κB mRNA和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達(dá)

圖1 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達(dá)水平的比較

2.2 各組MASSON染色結(jié)果及心肌梗死周邊區(qū)心肌間質(zhì)的膠原容積分?jǐn)?shù)比較 光學(xué)顯微鏡下，Sham組心肌無纖維化現(xiàn)象，均為正常的心肌纖維，未見纖維化的膠原纖維；MI組和SLP組均有心肌纖維化現(xiàn)象，SLP 組纖維化較MI 組明顯減輕（圖2）。與Sham 組比較，SLP 組和MI 組CVF 顯著升高（P＜0.05），與MI 組比較，SLP 組CVF 明顯降低（P＜0.05），見表2。

圖2 各組MASSON染色結(jié)果比較（×400）

表2 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)心肌間質(zhì)的膠原容積分?jǐn)?shù)比較

2.3 各組大鼠心肌梗死4 周后梗死周邊區(qū)心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá) 光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，Sham組未見Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)；而SLP組和MI 組梗死周邊區(qū)心肌間質(zhì)內(nèi)均可見被染成棕色片狀的Ⅰ型膠原蛋白及棕黃色斑片狀散在分布Ⅲ型膠原蛋白；SLP組Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)較MI組明顯減少（圖3、圖4）。SLP組和MI組梗死周邊區(qū)心肌間質(zhì)均有Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，與Sham組比較，Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的MIOD 明顯升高（P＜0.05），而與MI 組比較，SLP 組Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的MIOD顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠心肌梗死4 周后心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的結(jié)果

圖3 免疫組化測(cè)各組大鼠心肌梗死4周后梗死邊緣區(qū)Ⅰ型膠原蛋白（×400）

圖4 免疫組化測(cè)各組大鼠心肌梗死4周后梗死周邊區(qū)Ⅲ型膠原蛋白（×400）

3 討論

心肌梗死后心肌纖維化是心衰、惡性心律失常、心源性猝死等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理、生理基礎(chǔ)，如何有效的減輕心肌梗死后心肌纖維化是防治上述并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要靶點(diǎn)。

心肌纖維化涉及一系列復(fù)雜細(xì)胞因子及多種基因和蛋白的激活、表達(dá)與調(diào)控。有研究顯示，TGF-β1 是引起纖維化最重要的細(xì)胞因子，TGF-β1可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖分化為肌成纖維細(xì)胞，并可誘導(dǎo)Smad2/3的激活[9]，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解間動(dòng)態(tài)平衡被打破[10]，加速心肌纖維化形成。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TGF-β1 表達(dá)可從多途徑減輕心肌纖維化[11]。此外，炎癥因子的水平與心肌纖維化的程度密切相關(guān)，有研究顯示，抑制NF-κB 信號(hào)通路激活減少梗死心肌組織中促炎性細(xì)胞因子（TNFα，IL-1β 和IL-6）的生成[12]，減輕炎性細(xì)胞因子對(duì)心成纖維細(xì)胞的刺激作用，減少心肌間質(zhì)膠原蛋白的合成，從而減輕小鼠心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和心肌纖維化。

甘蔗是屬于禾本科甘蔗屬的植物，甘蔗葉中含有黃酮類、有機(jī)酸、多酚、維生素、甘蔗多糖等多種化學(xué)成分[7]，其中多糖在抗氧化、抗炎、加強(qiáng)免疫、降血糖等方面發(fā)揮著重要作用[7]。有研究報(bào)道，當(dāng)歸多糖通過抑制MAPK/NF-κB通路，減少心肌梗死后高濃度炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-6 的生成[13]，從而減輕炎癥反應(yīng)，延緩心肌梗死后心肌纖維化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甘蔗葉多糖能抑制TGF-β1、NF-κB mRNA 的表達(dá)（均P＜0.05），提示甘蔗葉多糖減少心梗后心肌纖維化可能與抑制促纖維化基因TGF-β1、NF-κB mRNA的表達(dá)有關(guān)。

此外，ERK1/2信號(hào)通路在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖及間質(zhì)纖維化中有重要的生物學(xué)功能[4]。有研究表明，磷酸化ERK1/2可以上調(diào)miR-21的表達(dá)，增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞的增殖、分化[14]，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，引起心肌間質(zhì)纖維化，而下調(diào)p-ERK1/2/ERK1/2 的表達(dá)，可減輕心肌纖維化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗葉多糖能下調(diào)p-ERK1/2/ERK1/2的表達(dá)（均P＜0.05），表明甘蔗葉多糖減少心肌梗死后心肌纖維化，亦可能與下調(diào)p-ERK1/2/ERK1/2的表達(dá)相關(guān)。

既往研究表明，Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白是心肌間質(zhì)的主要成分，其中Ⅰ型膠原與心肌舒張收縮的僵硬度有關(guān)，Ⅲ型膠原與室壁彈力有關(guān)，Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的合成增加，降解減少及合成與降解失衡，是心肌纖維化主要發(fā)病機(jī)制[16]。本研究Masson 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘蔗葉多糖能明顯減少心肌間質(zhì)的CVF，而免疫組化結(jié)果同樣表明甘蔗葉多糖能明顯減少心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)（均P＜0.05），表明甘蔗葉多糖能減少心肌梗死后心肌細(xì)胞外基質(zhì)過度蓄積，減輕心肌梗死后心肌纖維化。

總之，甘蔗葉多糖能減輕大鼠心肌梗死后梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與抑制促纖維化基因TGF-β1、NFκ-B mRNA的表達(dá)，下調(diào)p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表達(dá)有關(guān)。