微波輔助法提取潮州柑橘皮中總黃酮的工藝研究

劉志聰 鄭丹萍

摘要 [目的]優(yōu)化微波輔助提取潮州柑橘皮中總黃酮的工藝。[方法]采取微波輔助提取法，以乙醇濃度、料液比、微波功率和微波時(shí)間為因素，利用4因素3個(gè)水平正交試驗(yàn)，以總黃酮提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。[結(jié)果]影響潮州柑橘皮中黃酮提取率的因素依次為微波功率、微波時(shí)間、料液比和乙醇濃度，最佳提取工藝條件為45%乙醇濃度，料液比1∶30（g∶mL），微波時(shí)間60 s，微波功率640 W，在該工藝條件下柑橘皮中總黃酮提取率可達(dá)1.173%。[結(jié)論]該研究可為潮州柑橘皮黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 潮州柑橘皮;微波輔助提取;總黃酮;正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào) TS 209? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）23-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.053

Study on Microwave-assisted Extration of Total Flavonoids from Chaozhou Citrus Peel

LIU Zhi-cong， ZHENG Dan-ping

（School of Life Sciences and Food Engineering， Hanshan Normoal Universiy，Chaozhou， Guangdong 521000）

Abstract [Objective]To optimize the microwave-assisted extraction of flavonoids from Chaozhou citrus peel. [Method]Microwave assisted extraction was used to screen the best extraction process by taking ethanol concentration， solid-liquid ratio， microwave power and microwave time as factors， using 4 factors and 3 levels orthogonal test， and taking the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index. [Result]The main factors affecting the extraction rate of flavonoids from Chaozhou citrus peel were microwave power， microwave time， solid-liquid ratio and ethanol concentration. The optimum extraction conditions were 45% ethanol concentration， solid-liquid ratio 1∶30 （g∶mL）， microwave time 60 s and microwave 640 W. Under these conditions， the extraction rate of flavonoids from citrus peel could reach 1.173%. [Conclusion]This study can provide a scientific basis for the development and utilization of flavonoids in Chaozhou citrus peel.

Key words Chaozhou citrus peel;Microwave-assisted extraction;Total flavonoids;Orthogonal test

基金項(xiàng)目 廣東省粵東藥食資源功能物質(zhì)與治未病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2021B1212040015）。

作者簡(jiǎn)介 劉志聰（1983—），男，廣東興寧人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事天然活性產(chǎn)物研究。

收稿日期 2021-03-17;修回日期 2021-04-27

柑橘皮醫(yī)學(xué)上稱為陳皮，為蕓香科植物柑橘成熟果實(shí)的果皮，在我國(guó)有悠久的藥用歷史。我國(guó)古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，柑橘皮性味辛、微溫、無(wú)毒、入脾、肺經(jīng)，有理氣調(diào)中、燥濕消痰、行氣導(dǎo)滯的功效，具有消炎、抗?jié)?、抑菌及利膽等作用[1]。柑橘皮所含營(yíng)養(yǎng)成分除氨基酸外，其余成分含量均高于果肉，特別是果皮中富含橙皮苷、新橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、二晴川陳皮等黃酮類(lèi)化合物[2]。黃酮類(lèi)化合物（Flavonoids）在植物中廣泛存在，是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，作為一種功能成分，具有抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能、增強(qiáng)免疫力、調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)、護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病毒等功效[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取工藝優(yōu)化及功能活性分析進(jìn)行了大量研究[4-14]。柑橘皮中同樣含有多種黃酮類(lèi)化合物，對(duì)柑橘皮藥理作用的廣泛深入研究和臨床試驗(yàn)[2，15-16]證實(shí)，黃酮類(lèi)化合物起著非常重要的作用。

潮州柑在潮汕地區(qū)栽培歷史悠久，至今已有1 300余年的歷史，是潮汕地區(qū)著名水果品種之一，也是潮汕地區(qū)老百姓比較喜愛(ài)的水果之一，每年會(huì)產(chǎn)生大量的果皮資源待利用。近年來(lái)，從柑橘皮中提取香精油、果膠和類(lèi)胡蘿卜素等，已取得一定的研究成果，但尚未形成規(guī)模化生產(chǎn)。目前，柑橘皮除少量用于中藥和食品加工外，大部分柑橘皮被作為垃圾丟棄[15]。微波輔助提取技術(shù)具有耗能低、效率高、不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過(guò)優(yōu)化微波輔助提取潮州柑橘皮中黃酮的工藝，為潮州柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

市售新鮮的潮州柑橘洗凈取皮，在烘箱中（50 ℃）鼓風(fēng)干燥，將干燥后的柑橘皮經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目，備用。

1.2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)生物制品檢定所），95%乙醇、水、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠），手提式粉碎機(jī)，JA3003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），WD800G型微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司），800型離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠），WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 微波輔助提取柑橘皮總黃酮工藝流程（圖1）。

1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[16]。

精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.011 g，用60%（V/V）乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，用60%乙醇定容，搖勻配置成濃度為0.11 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液。準(zhǔn)確吸取0.11 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5只25 mL容量瓶中，加入15 mL 60%乙醇。然后加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al（NO）3，搖勻靜置6 min后加入2.0 mL 1 mol/L NaOH，用60%乙醇定容至刻度線，搖勻靜置12 min。以60%乙醇作為空白對(duì)照，在500 nm處測(cè)定其吸光度3次，取平均值。以蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），建立回歸方程：y=11.071 0x+0.000 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，具有較好的線性。

1.4.3 樣品中黃酮含量的測(cè)定。

取樣品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL 60%乙醇，分別加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻靜置6 min，加入0.3 mL 10% Al（NO）3，搖勻靜置6 min后加入2.0 mL 1 mol/L NaOH，最后用60%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以60%乙醇作為空白對(duì)照，在500 nm處測(cè)定吸光度，平行試驗(yàn)3次，吸光度取平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液的濃度及總黃酮含量。

總黃酮含量=C×F×V/m×100%

式中，C為樣品中黃酮濃度，mg/mL;F為溶液稀釋倍數(shù);V為溶液體積，mL;m為樣品質(zhì)量，mg。

1.4.4 微波提取工藝優(yōu)化。

1.4.4.1 單因素試驗(yàn)。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)可知，影響柑橘皮總黃酮含量提取的因素為乙醇濃度、料液比、微波功率及微波時(shí)間，為獲得最高的提取率，進(jìn)行以下單因素試驗(yàn)：

（1）乙醇濃度：準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末，在料液比1∶10，微波功率320 W，微波時(shí)間40 s的條件下，分別設(shè)置體積分?jǐn)?shù)為35%、45%、55%、65%、75%的乙醇進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）料液比：準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末，在體積分?jǐn)?shù)為55%乙醇，微波功率320 W，微波時(shí)間40 s的條件下，分別選擇料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50進(jìn)行試驗(yàn)。

（3）微波功率：準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末，在體積分?jǐn)?shù)為55%乙醇，料液比1∶20，微波時(shí)間40 s的條件下，分別設(shè)定微波功率為0、160、320、480、640 W進(jìn)行試驗(yàn)。

（4）微波時(shí)間：準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末，在體積分?jǐn)?shù)為55%乙醇，料液比1∶20，微波功率480 W的條件下，分別設(shè)定微波時(shí)間為20、30、40、50、60 s進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4.2 正交試驗(yàn)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度、料液比、微波時(shí)間、微波功率設(shè)計(jì)4因素3水平（L9（34））正交試驗(yàn)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖3可知，隨著乙醇濃度的升高，柑橘皮總黃酮的提取率也隨之增大，在乙醇濃度在55%時(shí)可達(dá)到最大值，繼續(xù)升高乙醇濃度，柑橘皮總黃酮提取率反而下降。這可能與微波加熱的機(jī)理有關(guān)，因?yàn)樘岣咭掖紳舛瓤梢栽龃筇崛?duì)樣品的滲透性，也可提高黃酮類(lèi)化合物的溶解度，從而提高柑橘皮總黃酮的提取率，而在使用微波加熱時(shí)，樣品中的極性分子尤其是水分子吸收微波能會(huì)產(chǎn)生大量熱量使樣品升溫，乙醇濃度增大的同時(shí)就減小了料液中水的比例，使樣品升溫減慢從而影響柑橘皮黃酮的提取率。此外，柑橘皮中的黃酮類(lèi)化合物含有易溶于水的黃酮苷和易溶于有機(jī)溶劑的黃酮苷元，且黃酮苷的含量高于黃酮苷元。當(dāng)乙醇濃度低時(shí)，隨著乙醇濃度的升高，黃酮苷元溶解增加，黃酮的提取率逐步增大，但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)55%，隨著乙醇濃度升高，易溶于水的黃酮苷溶解減少，導(dǎo)致總黃酮的提取率下降。因此，乙醇的最佳濃度初步定為55%。

2.1.2 料液比對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖4可知，隨著料液比的增大，柑橘皮總黃酮的提取率逐步提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí)，總黃酮的提取率最大，繼續(xù)增加溶劑量，提取率反而下降。究其原因可能是在料液比小于1∶20時(shí)，溶劑量過(guò)少導(dǎo)致柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物不能完全被提取;但料液比達(dá)到1∶20時(shí)，柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物被完全提取，因此黃酮提取率此時(shí)為最高;繼續(xù)增大料液比，由于溶劑量過(guò)多而使黃酮類(lèi)化合物提取率下降。這可能由于當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，提取劑對(duì)微波能的吸收增加，溫度升高減慢，導(dǎo)致細(xì)胞液對(duì)微波能吸收減少，細(xì)胞破裂不完全，柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物難以充分溶出。因此，提取的最佳料液比初步定為1∶20。

2.1.3 微波功率對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖5可知，柑橘皮總黃酮的提取率隨微波功率的增大而提高，在320～480 W時(shí)提高尤為明顯;當(dāng)微波功率大于480 W時(shí)，柑橘皮總黃酮提取率反而下降。這可能是由于微波輻射使細(xì)胞內(nèi)部溫度升高，壓力增大，細(xì)胞壁破裂，化合物從細(xì)胞中釋放出來(lái)。一定時(shí)間范圍內(nèi)，輻射功率越高細(xì)胞破碎越完全，柑橘皮中總黃酮的提取率越高;但微波功率過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物的活性成分被破壞，發(fā)生變性或者降解，從而導(dǎo)致柑橘皮中總黃酮的提取率降低。因此，提取的最佳微波功率初步定為480 W。

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖6可知，當(dāng)微波提取時(shí)間為20～50 s，柑橘皮總黃酮的提取率隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速提高，但持續(xù)延長(zhǎng)微波提取時(shí)間，總黃酮提取率反而下降。這很大程度是由于柑橘皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出需要一定時(shí)間，當(dāng)時(shí)間小于50 s時(shí)，由于時(shí)間短，細(xì)胞壁尚未完全破裂，總黃酮的提取率隨時(shí)間的增加而提高，而當(dāng)時(shí)間大于50 s，總黃酮部分被分解或變性，有效成分減少，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的微波會(huì)導(dǎo)致乙醇揮發(fā)速度加快，從而使總黃酮的提取率降低。因此，提取的最佳微波時(shí)間初步確定為50 s。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度（45%、55%、65%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30）、微波功率（320、480、640 W）、微波時(shí)間（40、50、60 s）4個(gè)因素作為變量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表1）。以柑橘皮中總黃酮的提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物的提取條件。用SPSS 11.5軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在4個(gè)影響因素中，對(duì)柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物提取率的影響從大到小依次為微波功率、微波時(shí)間、料液比、乙醇濃度。

采用正交助手軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，并對(duì)影響因素繪制了效應(yīng)曲線，結(jié)果見(jiàn)表3、圖7。

由表3的方差分析結(jié)果表明，微波功率對(duì)柑橘皮總黃酮提取的影響達(dá)到顯著水平，而乙醇濃度、料液比、微波時(shí)間均對(duì)柑橘皮總黃酮提取無(wú)顯著影響。

由圖7的效應(yīng)曲線可以看出，乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間4個(gè)因素對(duì)柑橘皮總黃酮提取率的影響效果變化趨勢(shì)不同，但都出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)。

綜上所述，由表2可知，以總黃酮提取率為指標(biāo)，正交試驗(yàn)的最佳組合為A1B3C3D3，即乙醇濃度為45%，料液比為1∶30，微波功率為640 W，微波時(shí)間為60 s。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)最佳組合提取工藝條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末，以45%乙醇，料液比1∶30，微波功率640 W，微波時(shí)間60 s進(jìn)行微波提取，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在最佳組合工藝提取條件下，5次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果接近，潮州柑橘皮總黃酮的平均提取率為1.173%，相對(duì)平均偏差為0.382%，說(shuō)明微波輔助法提取潮州柑橘皮中黃酮的優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

該研究通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察了乙醇濃度、料液比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)潮州柑橘皮中總黃酮提取效果的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)（L9（34）），以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化潮州柑橘皮中總黃酮的最佳提取工藝條件，即乙醇濃度為45%，料液比為1∶30，微波功率為640 W，微波時(shí)間為60 s，在該工藝條件下潮州柑橘皮中黃酮平均提取率為1.173%。

通過(guò)數(shù)據(jù)軟件分得出考4種因素的影響從大到小為微波功率、微波時(shí)間、料液比、乙醇濃度，即最重要的影響因素為微波功率，其次為微波時(shí)間，說(shuō)明微波對(duì)潮州柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物的提取有較為明顯的促進(jìn)作用。通過(guò)試驗(yàn)表明，潮州柑橘皮中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，能為今后潮州柑橘皮中黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃鎖義，羅燕，張婧萱，等.柑桔皮總黃酮的提取及鑒別[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（8）：1495-1496.

[2] 彭麗莎，方俊，孟德連，等.柑桔皮中功能成分研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2006（10）：18-19.

[3] 謝志剛，劉成倫.柑桔皮的綜合利用新進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2005，21（5）：77-80.

[4] 張福平，連少虹，陳蔚輝.佛手柑黃酮類(lèi)化合物提取工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，26（6）：99-101.

[5] 李楠，劉元，侯濱濱.黃酮類(lèi)化合物的功能特性[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，26（6）：139-141.

[6] 張福平，馬瑞君，王季梅，等.蓮霧葉黃酮類(lèi)化合物微波提取工藝及其抗氧化性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（22）：91-94.

[7] 韓秋菊，馬宏飛，李薇.微波法提取黑木耳黃酮類(lèi)化合物的研究[J].化學(xué)與生物工程，2011，28（11）：54-56.

[8] 滕海鵬，仲山民，吳峰華，等.菊米黃酮的微波提取工藝研究[J].食品工業(yè)，2011，32（2）：34-36.

[9] 蘇東林，單楊，李高陽(yáng)，等.柑桔皮總黃酮提取工藝優(yōu)化及其數(shù)學(xué)模型研究[J].食品科學(xué)，2008，29（5）：167-172.

[10] 張彥麗，茹鮮古麗·哈斯木，丁海燕，等.超聲-微波協(xié)同萃取法提取昆侖雪菊中總黃酮的研究[J].廣州化工，2011，39（21）：57-59.

[11] 周宇.微波輔助萃取艾葉總黃酮的工藝條件研究[J].化工時(shí)刊，2011，25（8）：8-10.

[12] 馬雄，喬良博，林華衛(wèi)，等.微波輔助提取花生殼總黃酮工藝研究[J].糧食與油脂，2011，24（10）：32-36.

[13] 謝婷，李智利，賀瓊.苦丁茶中黃酮的提取及含量測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32（9）：66-69.

[14] 王曉林，鐘方麗，郭海燕.微波法提取東北鐵線蓮總黃酮工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（4）：355-357.

[15] 范正國(guó)，章湘云.柑橘果皮綜合利用的研究[J].湖南化工，2000，30（4）：36-37.

[16] 雷昌貴，孟宇竹，蔡利.柑橘皮中黃酮提取工藝研究[J].中國(guó)食品添加劑，2008（2）：135-138.