青藏高原青稞抗白粉病SSR標(biāo)記分析

楊春葆 劉仁健

摘要 [目的]研究青藏高原青稞抗白粉病機(jī)制。[方法]以青稞基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)www.ncbi.nlm.nih.gov/sra（accession no.SRA201388）設(shè)計(jì)200對(duì)SSR引物，標(biāo)記關(guān)于抗白粉病基因位點(diǎn)并定位染色體。[結(jié)果]QK019和QK072兩個(gè)SSR引物與抗白粉病基因HvNEWENTRY標(biāo)記遺傳距離較近，分別為58.2，81.4 cM，該基因位于6H染色體上。[結(jié)論]該研究可為青稞抗白粉病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 青稞;青藏高原;白粉病;SSR;遺傳距離;染色體

中圖分類號(hào) S 512.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）23-0137-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.037

Mapping of Resistance Gene to Powdery Mildew in Highland Barley on Tibetan Plateau Using SSR Markers

YANG Chun-bao1，2， LIU Ren-jian1，2

（1. State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement，Lhasa， Tibet 850002;2. Researh Institute of Agriculture， Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences， Lhasa， Tibet 850002）

Abstract [Objective]In order to study the resistance mechanism of Tibetan Plateau highland barley to powdery mildew. [Method]Based on the highland barley genome data submitted by this project www.ncbi.nlm.nih.gov/sra （accession no. SRA201388）， 200 pairs of SSR primer markers related to powdery mildew resistance gene locus were designed and locate the chromosome.[Result] The results showed that the genetic distance between QK019 and QK072SSR primers and the powdery mildew resistance gene HvNEWENTRY marker was 58.2 and 81.4 cM， respectively， and the gene was located on chromosome 6H. [Conclusion]This study can provide a scientific basis for the study of resistance mechanism of highland barley to powdery mildew.

Key words Highland barley;Tibetan Plateau;Powdery mildew;SSR;Genetic distance;Chromosome

基金項(xiàng)目 西藏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（XZ2019ZRG-87（Z））。

作者簡(jiǎn)介 楊春葆（1985—），男，黑龍江海倫人，助理研究員，碩士，從事青稞遺傳育種研究。

通信作者，副研究員，碩士，從事青稞遺傳育種研究。

收稿日期 2021-03-16

青藏高原青稞（Hordeum vulgare var.nudum），禾本科，大麥屬，一年生草本植物，主要分布于西藏、青海、四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州、甘肅省甘南藏族自治州以及云南、貴州的部分地區(qū)，適宜生長在高原清涼氣候[1]，耐寒性強(qiáng)，生長期短，高產(chǎn)早熟，適應(yīng)性廣。青稞白粉病是由布氏白粉菌大麥?；停˙lumeria graminis f.sp.Hordei L.，Bgh）引起的真菌病害，其病原菌是專性的活體寄生菌，可引起青稞減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%以上，亦影響著青稞品質(zhì)[2]，也是制約青稞優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的因素之一。因此，篩選抗白粉病青稞品種（系）尤為重要。育種過程中，選育抗白粉病青稞品種（系）是防治白粉病最有效的途徑。與白粉病抗性相關(guān)基因在小麥等作物中已得到功能驗(yàn)證，MLO、PBZ017、RPW8、MIEL1-V、CMPG1-V、PM15/21、M1IW6、SCL在麥類作物抗白粉病研究中得到功能驗(yàn)證[3]。小麥對(duì)白粉病的抗性存在單基因或者寡基因決定的質(zhì)量抗性與由多基因控制的數(shù)量抗性2種形式，1粒小麥抗白粉病基因由1個(gè)隱性主效數(shù)量遺傳性狀（QTL）控制，被定位在Xcfd39/Xmag1491-Xmag1493區(qū)間，該基因與大麥MOL基因同源位點(diǎn)緊密連鎖[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，MOL基因隱性突變可提高大麥的抗白粉病能力，同時(shí)該基因?qū)Π追鄄【剐跃哂袕V譜性[7]。lncRNA全譜解析青稞白粉病菌差異表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，鈣依賴蛋白激酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、纖溶酶原激活物抑制劑1、絲氨酸型內(nèi)肽酶和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因表達(dá)水平較高，與青稞抗白粉病密切相關(guān)[8]。利用二粒小麥-普通小麥導(dǎo)入系，定位到來源于二粒小麥的抗白粉病主效QTL在普通小麥的4A染色體，同時(shí)該基因解釋表型達(dá)54%以上。由此可見，麥類作物抗白粉病基因是一個(gè)復(fù)雜的主效基因控制的QTL[9]。

隨著青稞基因組測(cè)序[10]的完成，已經(jīng)篩選到與青稞抗白粉病相關(guān)基因，但相關(guān)基因定位的研究相對(duì)較少。該研究以青藏高原青稞為試驗(yàn)材料，用200對(duì)SSR引物初步定位抗白粉病相關(guān)基因位點(diǎn)，旨在為西藏抗白粉病青稞育種及栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗白粉病品系WDM03744與敏感品種藏青13號(hào)均來源于西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，同時(shí)用于構(gòu)建WDM03744×藏青13號(hào)雜交F2代群體，并用于QTL定位。

1.2 基因組DNA提取

將親本及F2群體材料種植于每穴4 cm×4 cm的72穴長方形穴盤中。三葉一心取樣期提取親本及F2群體基因組DNA，CTAB法提取基因組DNA，并檢測(cè)DNA含量，OD260/OD280為1.7～1.9為合格，-20 ℃存儲(chǔ)備用。

1.3 引物選擇合成

根據(jù)提交的青稞基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)200對(duì)SSR引物，與大麥耐鹽性相關(guān)性狀緊密連鎖的標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。引物由Invitrogen公司合成，引物序列及PCR擴(kuò)增程序見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增及銀染

PCR擴(kuò)增在PE9600（Perkin Elmer，Norwalk，CT，USA）PCR儀上運(yùn)行。反應(yīng)體系為12.5 μL，內(nèi)含DNA模板10～20 ng，引物各2.5 pmol，d NTPs 2.5 nmol，MgCl2 18.7 nmol，0.2 U Taq DNA聚合酶與1×PCR緩沖液。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min，然后按照94 ℃ 30 s，50～60 ℃（視引物而定）30 s，74 ℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在9%非變性聚丙烯酰氨凝膠上電泳分離，然后0.2%銀染，0.15%NaOH顯影（使用時(shí)加入5 mL/L甲醛）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及遺傳圖譜構(gòu)建

采用MAPMAKER/EXP 3.0b計(jì)算分子標(biāo)記與抗病基因之間的遺傳距離，用Mapdraw V2.1和MAPCHART2.2繪制抗病基因的分子標(biāo)記連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性檢測(cè)

利用www.ncbi.nlm.nih.gov/sra（accession no.SRA201388）設(shè)計(jì)多態(tài)性抗白粉病SSR引物共 200對(duì)，并對(duì)雙親藏青13號(hào)（P1）與WDM03744（P2）進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中25對(duì)引物在雙親之間存在多態(tài)性，占引物總數(shù)的25%，部分引物的篩選結(jié)果見圖1。

2.2 SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

抗、感親本篩選表明，200對(duì)SSR引物中，有25對(duì)引物在親本W(wǎng)DM03744與藏青13號(hào)表現(xiàn)出多態(tài)性。進(jìn)一步利用這25對(duì)引物在抗、感池進(jìn)行篩選，其中有5對(duì)（QK155、QK025、QK019、QK079和QK072）引物具有豐富的多態(tài)性。這5對(duì)引物在抗感小群體進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，它們可以在抗病小群體和抗病親本之間與感病小群體和感病親本之間分別擴(kuò)增出相同的特異條帶，說明這5對(duì)引物相互連鎖。根據(jù)NCBI提交青稞基因組數(shù)據(jù)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)5對(duì)引物與HvNEWENTRY相互連鎖。HvNEWENTRY基因位于6H染色體上，這5對(duì)引物標(biāo)記該基因在6H染色體。

利用Mapmaker Exp 3.0計(jì)算遺傳距離和MapDraw v2.1繪制遺傳連鎖圖譜，結(jié)果顯示，HvNEWENTRY及其連鎖標(biāo)記的位置順序?yàn)镼K155、QK025、QK019、HvNEWENTRY、QK079和QK072，其遺傳距離見圖2，HvNEWENTRY兩側(cè)連鎖標(biāo)記QK019和QK072的遺傳距離分別為58.2、81.4 cM，遺傳距離相較于其他較近。

3 討論

麥類作物白粉病菌株具有群體大、變異快等特點(diǎn)，在單一抗源下，一旦出現(xiàn)新型病毒植株，抗病基因喪失，引起該種類型白粉病的廣泛流行，造成作物減產(chǎn)[11]。國內(nèi)外已鑒定出100余個(gè)抗小麥白粉病基因或QTL，其中已被正式命名的基因位點(diǎn)有100余個(gè)[12]。Pm4d、Mlm2033、Mlm80、Pm1b及pm2026是小麥主要的抗性基因，并在小麥中已得到定位。麥類作物中抗白粉病基因多為顯性遺傳，同時(shí)為主效基因控制[13]。目前雖然定位到的抗病性基因較多，但可有效用于生產(chǎn)上的抗病基因甚少。因此，不斷挖掘新的抗白粉病基因，保持抗病基因抗源的多元化至關(guān)重要[14]。

抗白粉病種質(zhì)資源的利用與發(fā)掘是提高作物抗病的主要途徑及基本途徑[15]。篩選到抗病性品種（系）是青稞抗白粉病研究的基礎(chǔ)，以此構(gòu)建群體，篩選更多的抗病材料有利于青稞產(chǎn)量栽培及推廣。該試驗(yàn)定位到了與青稞抗白粉病基因HvNEWENTRY的位點(diǎn)，為后續(xù)開展抗白粉病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)的SSR引物較少，難以精細(xì)定位該基因，因此，后續(xù)需繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)抗白粉病基因的研究與定位。

西藏是青稞的主產(chǎn)地，不僅要加強(qiáng)對(duì)白粉病的防治力度，更要注重青稞產(chǎn)業(yè)發(fā)展，同時(shí)青稞也是藏族人民基本的糧食來源，研究青稞抗白粉病機(jī)制及提高青稞產(chǎn)量也是解決部分貧困地區(qū)糧食缺乏的一種有效方法。

4 結(jié)論

通過構(gòu)建抗感池，檢測(cè)200對(duì)抗白粉病基因SSR引物的多態(tài)性，其中只有25對(duì)引物具有豐富的多態(tài)性，以此為基礎(chǔ)對(duì)青稞F2群體采用Mapmaker Exp 3.0計(jì)算遺傳距離和MapDraw v2.1繪制遺傳連鎖圖譜，其中QK155、QK025、QK019、QK079和QK072定位在HvNEWENTRY的兩側(cè)，該基因位于4H染色體上，其中QK019和QK072定位HvNEWENTRY基因遺傳距離最近，初步可認(rèn)為是該基因的粗定位SSR引物。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭慧娟，賈舉慶，李欣，等.小麥種質(zhì)CH7015中抗白粉病基因的SSR定位[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，34（6）：203-208.

[2] 侯麗媛，董艷輝，張春芬，等.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在蘋果種質(zhì)資源及遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（6）：1107-1114.

[3] 孫洪寶，許勇，張春秋，等.比較基因組學(xué)在甜瓜白粉病抗病基因Pm-2F連鎖標(biāo)記開發(fā)中的應(yīng)用[J].中國瓜菜，2019，32（8）：187-188.

[4] 馬超，董振杰，田修斌，等.來自西爾斯山羊草的抗小麥白粉病基因Pm57抗性喪失突變體的篩選與鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2020，21（2）：386-393.

[5] 陳芳，喬麟軼，李銳，等.小麥新種質(zhì)CH1357抗白粉病遺傳分析及染色體定位[J].作物學(xué)報(bào)，2019，45（10）：1503-1510.

[6] 王掌軍，劉妍，張雙喜，等.寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2代抗病性及分子標(biāo)記鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，31（5）：677-687.

[7] 費(fèi)新茹，朱娟，郭暉，等.大麥白粉病抗性的遺傳分析與QTL定位[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，33（5）：888-893.

[8] 葉衛(wèi)軍，楊勇，周斌，等.分子標(biāo)記在綠豆遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位研究中的應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2017，18（6）：1193-1203.

[9] ZENG X Q，LONG H，WANG Z，et al.The draft genome of Tibetan hulless barley reveals adaptive patterns to the high stressful Tibetan Plateau[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（4）：1095-1100.

[10] 李思怡，盧浩，趙莉，等.利用緊密連鎖抗白粉病基因的SSR標(biāo)記鑒定甜瓜種質(zhì)[J].分子植物育種，2016，14（9）：2435-2440.

[11] 付必勝，劉穎，張巧鳳，等.與小麥抗白粉病基因Pm48緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)[J].作物學(xué)報(bào)，2017，43（2）：307-312.

[12] 徐志，章振羽，姬紅麗，等.四川小麥品種的遺傳多樣性及其對(duì)條銹病和白粉病的抗性[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2017，37（2）：258-267.

[13] 劉婉輝，董宏圖，李映輝，等.栽培一粒小麥3AA30中抗白粉病基因的鑒定及分子標(biāo)記定位[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17（3）：536-540.

[14] PANSTRUGA R，KUHN H.Mutual interplay between phytopathogenic powdery mildew fungi and other microorganisms[J].Mol Plant Pathol，2019，20（4）：463-470.

[15] BOURRAS S，PRAZ C R，SPANU P D，et al.Cereal powdery mildew effectors：A complex toolbox for an obligate pathogen[J].Curr Opin Microbiol，2018，46：26-33.