消毒方式對(duì)綠豆愈傷組織培養(yǎng)的影響

王珅 范保杰 王彥 曹志敏 蘇秋竹 張志肖 劉長(zhǎng)友 田靜

摘要 為明確綠豆愈傷組織培養(yǎng)體系中最佳種子消毒方式，利用乙醇、次氯酸鈉（NaClO）、氯化汞（HgCl2）和氯氣（Cl2）作為消毒劑，組合搭配16種消毒方式對(duì)綠豆種子進(jìn)行消毒處理。對(duì)發(fā)芽率、污染率、種皮破損率及愈傷組織誘導(dǎo)率等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析。結(jié)果表明，75%乙醇 30 s+1.0% NaClO 10 min的消毒方式處理的綠豆種子發(fā)芽率為90.11%，該處理無(wú)污染，種皮無(wú)破損，出愈率達(dá)到92%，誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃綠色塊狀，結(jié)構(gòu)緊密且質(zhì)地硬，生長(zhǎng)速率與生長(zhǎng)狀況良好。因此，該消毒方式適用于綠豆愈傷組織培養(yǎng)過程中的種子消毒，且有利于綠豆子葉節(jié)的愈傷誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 綠豆;種子;消毒方式;愈傷誘導(dǎo)

中圖分類號(hào) S 522? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）23-0029-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.008

Effects of Different Disinfection Methods on Callus Culture of Mung Bean（Vigna radiata）

WANG Shen， FAN Bao-jie， WANG Yan et al

（Institute of Cereal and Oil Crops， Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Hebei Laboratory of Crop Genetic and Breeding， Shijiazhuang， Hebei 050035）

Abstract In order to determine the best disinfection method of mung bean seeds in callus culture system， 16 disinfection methods were used to disinfect mung bean seeds with ethanol / NaClO / HgCl2 and chlorine as disinfectants. In addition， the germination rate， pollution rate， seed coat damage rate and callus induction rate were comprehensively evaluated and analyzed. The results showed that the germinating rate of mung bean seeds treated with 75% ethanol for 30 s+1.0% NaClO for 10 min was 90.11%， and there was no pollution， the seed coat was not damaged， the callus induction rate was 92%， and the callus was light yellow green， compact in structure and hard in texture. Therefore， this method was suitable for seed disinfection in the process of mung bean callus culture and is conducive to the callus induction of mung bean cotyledon node.

Key words Mung bean;Seed;Disinfection method;Callus induction

基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFD1000700/2019YFD1000703）;河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所青年創(chuàng)新基金課題（2020LYS02）;國(guó)家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-08）;河北省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系雜糧雜豆創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（HBCT2018070203）;河北省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新工程（2019-4-2-8）。

作者簡(jiǎn)介 王珅（1986—），男，河北石家莊人，助理研究員，碩士，從事綠豆遺傳育種研究。通信作者：田靜，研究員，碩士，從事綠豆遺傳育種研究;劉長(zhǎng)友，副研究員，博士，從事綠豆遺傳育種研究。田靜和劉長(zhǎng)友為共同通信作者。

收稿日期 2021-03-24

綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek]古名菉豆、植豆，屬豆科（Leguminosae），蝶形花亞科（Papilionoideae），豇豆屬（Vigna）。富含蛋白質(zhì)及多種抗氧化活性物質(zhì)，在現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)中具有平衡膳食、清熱解毒、消暑利水等作用[1-2]。綠豆作為一種小宗雜糧作物，系統(tǒng)選育、雜交選育及輻照育種等常規(guī)方法仍是綠豆育種的主要手段。鑒于常規(guī)育種局限性與生物技術(shù)的快速發(fā)展，有必要對(duì)綠豆開展轉(zhuǎn)基因育種研究。再生體系建立是利用基因工程技術(shù)進(jìn)行品種改良的重要環(huán)節(jié)，合適的消毒方式對(duì)于高效再生體系建立具有重要影響。

植物組織再生過程中常見消毒方式包括75%乙醇消毒法、次氯酸鈉消毒法、氯氣消毒法和氯化汞消毒法。吳鵬飛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，75%乙醇消毒30 s對(duì)草莓花藥愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。陳華濤等[4]利用1%、3%、5%次氯酸鈉對(duì)小豆種子分別進(jìn)行10、20、30 min消毒處理，發(fā)現(xiàn)單一濃度次氯酸鈉隨處理時(shí)間延長(zhǎng)消毒效果增強(qiáng)，且次氯酸鈉濃度升高也可提高消毒效果。陳新等[5]在建立小豆組織再生體系中利用了75%乙醇+5%次氯酸鈉的消毒方式。大豆再生體系中多采用氯氣消毒法。劉銀等[6]研究發(fā)現(xiàn)，氯氣消毒處理后的大豆種子萌發(fā)率達(dá)100%且污染率為0;李海燕等[7]也認(rèn)為，氯氣對(duì)大豆種子消毒效果較好;劉海坤[8]通過研究不同時(shí)間氯氣處理對(duì)大豆種子消毒效果的影響，發(fā)現(xiàn)1～24 h氯氣消毒效果差異不大，消毒時(shí)間太長(zhǎng)可能對(duì)種子傷害較大從而影響種子活力。范淑芳[9]采用75%乙醇+0.1%氯化汞對(duì)華中枸骨新梢莖段進(jìn)行外植體消毒，獲得較好的消毒效果，該消毒方式對(duì)后期愈傷組織的形成與生長(zhǎng)較好。氯化汞消毒法在豇豆[10]與菜豆[11]組織培養(yǎng)技術(shù)研究中為主要消毒方式，但綠豆組織培養(yǎng)體系中消毒方式還不明確。鑒于此，筆者針對(duì)綠豆消毒方法展開系統(tǒng)試驗(yàn)，探討不同消毒方式對(duì)綠豆愈傷組織培養(yǎng)的影響，以期找到最佳消毒方式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種選用保綠942-34，由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理。選取健康、飽滿、無(wú)破損、大小均勻的綠豆種子置于燒杯中，將雜質(zhì)漂洗干凈后放入超凈工作臺(tái)，參照已報(bào)道文獻(xiàn)[3-10]設(shè)置16種消毒方式（表1）。消毒處理后均用無(wú)菌水沖洗6次，洗去殘留消毒劑。

1.2.2

種子發(fā)芽。將消毒處理后的種子接種到MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種30粒，封口膜封好后置于16 h光照/8 h黑暗的培養(yǎng)室中26 ℃培養(yǎng)5 d。每種消毒處理后的種子接種10皿，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)污染率及無(wú)菌發(fā)芽率。

1.2.3 外植體制備。根據(jù)1.2.2的試驗(yàn)結(jié)果，選用消毒效果好的O和P方式處理的綠豆幼苗，切除初生葉，取帶有3～5 mm上、下胚軸的子葉節(jié)作為外植體，接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+2，4-D 4 mg/L+6-BA 1 mg/L）上，每皿接種5～7個(gè)，設(shè)3次重復(fù)，14 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%

污染率=污染種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%

無(wú)菌發(fā)芽率=無(wú)菌發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%

種皮破損率=種皮破損種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%

出愈率=愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

采用Excel和DPS（v18.10高級(jí)版）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析;采用Duncan氏法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式處理對(duì)綠豆污染率與發(fā)芽率的影響

2.1.1 單獨(dú)消毒方式效果評(píng)價(jià)。

利用消毒方式A、B、C處理綠豆種子，培養(yǎng)5 d后種子發(fā)芽率均超過85%;種子污染率分別為64.11%、62.67%、62.33%。這表明單獨(dú)使用75%乙醇處理即使延長(zhǎng)消毒時(shí)間也不能有效降低污染率，因此單獨(dú)使用75%乙醇處理不能獲得良好消毒效果。

利用消毒方式D、E、F、G、H、I、J、K、L處理綠豆種子，即濃度為1.0%、2.5%、5.0%次氯酸鈉分別處理綠豆成熟種子10、20、30 min都可有效滅菌，污染率均為0。但是隨著濃度升高以及處理時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使發(fā)芽率降低（表2）。同一濃度次氯酸鈉隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)綠豆種皮破損率明顯提升（表3）。種皮結(jié)構(gòu)破壞后導(dǎo)致種子活性降低，影響發(fā)芽率。種皮破損的綠豆培養(yǎng)5 d后，發(fā)芽速率與生長(zhǎng)狀態(tài)明顯低于正常綠豆（圖1）。

利用消毒方式M、N處理綠豆種子，結(jié)果顯示氯氣消毒效果較好，但綠豆發(fā)芽率卻顯著下降（表4）。原因可能是氯氣造成綠豆傷害，使其活性降低，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，傷害加重，從而導(dǎo)致發(fā)芽率降低。

單獨(dú)使用75% 乙醇（污染率高）或單獨(dú)使用NaClO（發(fā)芽率較低）都無(wú)法取得理想消毒效果。氯氣消毒導(dǎo)致綠豆發(fā)芽率顯著降低（46.33%）。

2.1.2 復(fù)合消毒方式效果評(píng)價(jià)。

利用復(fù)合消毒方式O和P，即75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min與75%乙醇30 s+1% HgCl2 10 min均能夠達(dá)到污染率為0的理想消毒效果，消毒方式O的種子發(fā)芽率顯著高于消毒方式P（表5），且培養(yǎng)3 d后種子發(fā)芽速率與生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于消毒方式P（圖2）。

該研究顯示，復(fù)合消毒方式對(duì)綠豆種子損傷效果較小，并且種子發(fā)芽率顯著高于單獨(dú)消毒方式（圖3）。

2.2 復(fù)合消毒方式對(duì)綠豆愈傷誘導(dǎo)的影響

采用消毒效果較好的O和P復(fù)合消毒方式處理后的綠豆種子，培養(yǎng)5 d后切取子葉節(jié)接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（pH≈5.8）上。結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)條件下O消毒方式處理后的子葉節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)率較高，為92.5%，P消毒方式處理后的子葉節(jié)出愈率為80.0%。此外，經(jīng)過O消毒方式處理后的愈傷組織呈黃綠色塊狀，結(jié)構(gòu)緊密且質(zhì)地硬，其生長(zhǎng)速率與生長(zhǎng)狀況優(yōu)于P消毒方式（圖4）。

P消毒方式處理后的子葉節(jié)在愈傷組織誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象（圖5），愈傷褐化率11.67 %，O消毒方式?jīng)]有出現(xiàn)褐化的愈傷。

2種復(fù)合消毒方式消毒效果相同，但P消毒方式不足之處在于發(fā)芽率與出愈率明顯低于消毒方式O，原因可能是消毒過程中氯化汞對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致愈傷誘導(dǎo)率降低，這與陶興魁等[12]對(duì)藍(lán)莓外植體消毒方法比較的研究結(jié)果相近。綜上可知，75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min更有利于綠豆子葉節(jié)誘導(dǎo)愈傷組織，是綠豆愈傷組織培養(yǎng)較為理想的消毒方式。

3 討論

發(fā)芽率能夠反映不同消毒方式處理后的綠豆種子活性，種子活性會(huì)影響到外植體質(zhì)量，進(jìn)而影響出愈率。研究發(fā)現(xiàn)，單一的次氯酸鈉消毒方式隨著濃度升高，發(fā)芽率明顯降低。氯氣有較強(qiáng)消毒效果，李海燕等[7]使用氯氣消毒法可對(duì)大豆成熟種子消毒且成功獲得再生大豆幼苗。在該研究中氯氣雖然能夠有效去除綠豆種子表面微生物，但發(fā)芽率顯著降低，這與陳華濤等[4]對(duì)小豆種子消毒方法研究結(jié)果一致。

消毒效果直接影響綠豆愈傷組織培養(yǎng)，單一的75%乙醇消毒處理時(shí)即使時(shí)間延長(zhǎng)也不能獲得理想的無(wú)菌種子。濃度為2.5%及5.0%的次氯酸鈉處理10 min可有效除菌，但會(huì)對(duì)綠豆種皮產(chǎn)生較大傷害，加劇了種子活性損傷，導(dǎo)致發(fā)芽與生長(zhǎng)速率降低。1%次氯酸鈉處理后的綠豆消毒效果較好，且發(fā)芽率較高，但隨著1%次氯酸鈉作用時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率降低，其原因可能是綠豆種皮較薄，對(duì)次氯酸較為敏感，因此消毒作用時(shí)間控制在10 min既能達(dá)到良好消毒效果又不會(huì)損傷綠豆活性。

植物離體組織培養(yǎng)體系中外植體消毒方式多種多樣，選擇合適種子消毒方式是獲得大量無(wú)菌外植體的基礎(chǔ)。消毒方式選用原則是獲得無(wú)菌效果且不影響愈傷組織的誘導(dǎo)。該研究通過比較各種消毒方式處理后的污染率、發(fā)芽率、出愈率及愈傷組織效果發(fā)現(xiàn)，75%乙醇+1.0% NaClO處理后的綠豆消毒效果好，發(fā)芽率與出愈率較高，愈傷組織效果較好。與75%乙醇+1.0% HgCl2消毒方式相比，有以下優(yōu)勢(shì)：①對(duì)綠豆傷害小，保證高發(fā)芽率的同時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)效果好;②易于采購(gòu)，使用后的廢液對(duì)環(huán)境相對(duì)友好;③實(shí)驗(yàn)人員操作安全，實(shí)驗(yàn)室安全風(fēng)險(xiǎn)低。因此，在構(gòu)建綠豆愈傷組織培養(yǎng)體系時(shí)，75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min是一種較好的種子表面消毒方式。

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