紅曲磷蝦油軟膠囊的毒理安全性評價

張金秋， 江 賀， 張馨欣， 侯萬萍， 鄒 慧

(長春康彼達科技有限公司， 吉林 長春 130012)

隨著物質生活水平的提高和飲食結構的改變，人們攝入高熱量、高油脂食物的量增加，長期攝入高脂食物會干擾體內脂質代謝和抗氧化能力。當體內血脂過高后，致使體內形成大量自由基，導致細胞受損，加速細胞凋亡，人體衰老。脂肪在內臟中過多，會導致內臟功能減少；在血管內沉積，形成動脈粥樣硬化，易引發(fā)心腦血管等疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，心腦血管疾病患者血液動力學檢查中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-D)均有所升高，表明心腦血管疾病與血脂異常存在一定的關系。全球心腦血管的發(fā)病率逐年上升，已嚴重威脅到人的健康，據(jù)不全統(tǒng)計，每年因心腦血管等疾病導致的死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)20%以上[1]。因此，有效控制血脂是預防動脈粥樣硬化的有效手段之一。

紅曲為藥食兩用傳統(tǒng)中藥材，主要含洛伐他汀(Monacolin K)、麥角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素[2]等，具有調節(jié)脂代謝、降低血壓、降低血糖、預防和治療骨質疏松等廣泛的藥理作用[3-5]。南極磷蝦油作為海洋新興油脂，其含有多種不飽和脂肪酸等活性成分，其中具有代表性的EPA、DHA以磷脂形式存在，活性優(yōu)于甘油三酯或乙酯，具有調節(jié)血脂作用[6-8]。玉米油中含豐富的不飽和脂肪酸、甾醇等成分，其中，亞油酸占油脂總量的50%以上，研究證明玉米油有顯著降低血清膽固醇的作用[9]?！凹t曲磷蝦油軟膠囊”是由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司研制，具有輔助降血脂功能的保健食品，以紅曲粉、南極磷蝦油為原料，玉米油等為輔料制成的軟膠囊。為評價紅曲磷蝦油軟膠囊的安全性，依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003年版)和《食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗急性毒性劑量分級標準》(GB 15193.3—2014)，采用急性毒性試驗、遺傳毒性試驗、28 d喂養(yǎng)試驗進行安全性考察?，F(xiàn)將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 紅曲磷蝦油軟膠囊 其是以紅曲粉、南極磷蝦油為原料，玉米油為輔料，添加一定的蜂蠟作為助懸劑制成。該膠囊由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司研制(批號：20180701)，規(guī)格0.5 g/粒，人體推薦用量為2 粒/次、2次/d。供試品為紅曲磷蝦油軟膠囊的內容物。

1.1.2 儀器與設備 電子天平(ME204E、AB135-S型)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；水浴鍋(HH-S114型)，金壇市華龍實驗儀器廠；血細胞分析儀(BC-280 vet型)、全自動生化分析儀(BS-420型)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；尿液分析儀(Uritest-200 B)，桂林優(yōu)利特電子集團有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(SPX-100B-Z)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；超凈工作臺(SJ-CJ-1FD)，蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.1.3 試驗動物 SPF級SD大鼠、昆明小鼠，由西安交通大學醫(yī)學部動物實驗室提供。

1.1.4 藥物、試劑等 環(huán)磷酰胺、敵克松、秋水仙堿、疊氮化鈉(NaN3)、2-氨基芴(2-AF)、1，8-二羥基蒽醌、大鼠肝微粒體酶(S9)、小牛血清、Giemsa染液、伊紅染液、磷酸鹽緩沖溶液、尿液分析試紙、生化試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、TA1535、TA97a、TA98、TA100、TA102菌株，均購自于上海北思生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠急性毒性試驗 選取SD大鼠20只，雌雄各半，灌胃前禁食16 h，不限飲水，稱取供試品100 g，按18.43 mL/kg體重(相當于人體推薦用量的460倍)分2次(間隔6 h)經(jīng)口灌胃，灌胃后連續(xù)14 d觀察記錄SD大鼠的中毒癥狀及死亡情況。同時選取20只SD大鼠，雌雄各半，做空白對照試驗。試驗0 d、7 d和14 d稱量大鼠體重，試驗結束后處死解剖[10]。

1.2.2 遺傳毒性試驗

1) 細菌回復突變試驗。選擇經(jīng)基因型鑒定符合試驗要求的5株組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(TA1535、TA100、TA97a、TA98、TA102)進行試驗。稱取1.0 g供試品，加DMSO至20 mL，混合均勻，第1次5個受試物濃度分別為50 μg/皿、158 μg/皿、500 μg/皿、1 581 μg/皿和5 000 μg/皿，第2次分別為8 μg/皿、4 0 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿和5 000 μg/皿，另設陽性對照組、自發(fā)回變組和去DMSO對照組，TA1535、TA100：NaN3(1.5 μg，-S9)；TA97a、TA98、TA102：敵克松(50.0 μg，-S9)，TA102：1，8-二羥基蒽醌(50.0 μg，+S9)；TA1535、TA97a、TA98、TA100：2-AF(10.0 μg，+S9)。各組受試物在0.103 MPa下濕熱滅菌20 min。各組均設3個平行皿，加入0.1 mL菌株增菌液，0.1 mL受試物(或對照物)和0.5 mL S9混合液(試驗組分別設加與不加S9組)，加入保溫的頂層培養(yǎng)基中混合均勻后用平鋪法置于底層培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計菌落數(shù)，試驗2次重復。

2) 小鼠骨髓細胞微核試驗。取小鼠50只，平均分成5組(每組雌雄各半)，分別設供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組，另設陰性對照組(大豆油)及陽性對照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)。采用30 h灌胃法，第2次(與第1次間隔24 h)灌胃后6 h頸椎脫臼處死，取小鼠胸骨擠出骨髓，混合小牛血清，制片，干燥后固定、Giemsa染色，在顯微鏡下每只小鼠觀察1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，計算微核發(fā)生率。

3) 小鼠精原細胞畸變試驗。取30只雄性小鼠，平均分成6組，分別設供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組，另設溶劑對照組(去離子水)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)。連續(xù)灌胃5 d，高劑量組分別于末次給藥后24 h和48 h處死，其余劑量組在末次給藥后24 h處死，處死前5 h按5 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射秋水仙素溶液(注射體積20 mL/kg BW)，將所有小鼠頸椎脫臼處死，取雙側附睪尾剪碎，加生理鹽水游離出精子，涂片，用1%伊紅染色制片，用光學顯微鏡觀察完整精子，每只小鼠觀察100個精子，記錄各類畸形精子數(shù)，計算畸變發(fā)生率。

1.2.3 28 d喂養(yǎng)試驗 選用68～93 g離乳SD大鼠100只，平均分成5組(每組雌雄各半)，分別設供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組，另設陰性對照組(大豆油)。停藥后15 d設高劑量組恢復期組和陰性組，每組10只，按4.0 mL/kg每天經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)28 d，觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)、中毒癥狀及死亡情況。灌胃結束后禁食隔夜，逐只稱重，用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血測定血液學指標和血液生化指標。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對小鼠骨髓細胞微核試驗數(shù)據(jù)進行u檢驗；小鼠精原細胞畸變試驗數(shù)據(jù)進行二項分布統(tǒng)計；28 d喂養(yǎng)試驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。

2 結果與分析

2.1 紅曲磷蝦油軟膠囊的急性毒性

從表1看出，用紅曲磷蝦油軟膠囊18.43 g/kg灌胃后大鼠生長良好，未見體重變化，未見有明顯中毒癥狀，14 d觀察期內無死亡。心、肝、脾、肺、腎、腸、胃等主要臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。表明，紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠LD50均大于18.43 g/kg，按劑量分級標準，紅曲磷蝦油軟膠囊屬于無毒級別。

表1 紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠的急性毒性

2.2 紅曲磷蝦油軟膠囊的遺傳毒性

2.2.1 細菌回復突變試驗 從表2、表3看出，回變菌落數(shù)紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組與未處理對照組(自發(fā)回變組)相近，且未發(fā)現(xiàn)劑量-反應關系，試驗結果為陰性，說明紅曲磷蝦油軟膠囊在+S9和―S9情況下，對5種類型菌株均無致突變性。

表2 第1次試驗的回變菌落數(shù)

表3 第2次試驗的回變菌落數(shù)

2.2.2 小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗 從表4看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組的PCE/NCE與陰性對照組差異均不顯著(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對骨髓紅細胞增殖無明顯抑制；雌、雄小鼠陽性對照組的微核率與陰性對照組間差異極顯著，表明紅曲磷蝦油軟膠囊小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗結果均為陰性。

表4 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下小鼠骨髓多染紅細胞微核率(n=5)

2.2.3 小鼠精原細胞畸變試驗 染色體畸變類型主要以斷裂、斷片為主，一般正常小鼠精原細胞畸變率為0.8%～3.4%。從表5看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組與陰性對照組間差異不顯著(P>0.05)，細胞畸變率陽性對照組與陰性對照組間差異極顯著(P<0.01)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對小鼠精原畸變試驗為陰性。

表5 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下小鼠的精子畸變情況

2.3 28 d喂養(yǎng)試驗

2.3.1 行為體征等 28 d喂養(yǎng)試驗期間紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠的外觀形態(tài)與對照組無明顯差異，生長良好，未發(fā)現(xiàn)異常行為和體征，未出現(xiàn)明顯中毒癥狀和死亡。從表6看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠體重增重、總進食量、總食物利用率與對照組間差異不顯著(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠行為特征無影響。

表6 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的增重、食物總利用率(n=10)

2.3.2 血液學及血液生化指標 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量灌胃大鼠28 d，血液紅細胞計數(shù)、血紅蛋白水平、白細胞計數(shù)及其分類等指標，均滿足方差齊要求。從表7、表8看出，紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量組的各項指標與陰性對照間無顯著差異(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠血液學及血液生化各項指標無影響。

表7 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的生血液學指標(n=10)

表8 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的血液指標(n=10)

2.3.3 尿液與臟體指標 從表9、表10看出，紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠的尿液、禁食后體重、臟體比等指標與陰性對照組間無顯著差異(P>0.05)，表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠尿液、臟體指標無影響。

表9 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的尿液指標(n=10)

表10 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的臟體指標(n=10)

2.3.4 病理組織學 大鼠解剖肉眼未見異常。組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，紅曲磷蝦油軟膠囊高劑量組雌鼠有1例輕度肝小葉空泡變、1例腎輕度淤血、1例胃炎細胞浸潤，雄鼠有1例肝小葉炎細胞浸潤、1例脾色素沉積，其余組織均未見異常；陰性對照組雌鼠有1例輕度肝小葉空泡變、1例胃黏膜輕度水腫，雄鼠有1例腎皮質部腎小管空泡變、1例胃炎細胞浸潤，其余組織均未見異常。紅曲磷蝦油軟膠囊高劑量組(恢復期)雌鼠有1例肝小葉顆粒變性，雄鼠1睪丸間質水腫；陰性對照組(恢復期)雄鼠1例肝少量炎細胞浸潤、1例肝小葉空包變、1例腎皮質部腎小管腫脹，雌鼠1例胃少量炎細胞浸潤。以上病理學僅在個別大鼠中發(fā)生，各組病理變化無明顯差異，表明被檢臟器未見與紅曲磷蝦油軟膠囊有關的病理學改變。

3 結論

紅曲磷蝦油軟膠囊是由紅曲粉、南極磷蝦油以及玉米油配比，按照軟膠囊工藝制成的一款具有降血脂功能的保健食品。研究結果表明，紅曲磷蝦油軟膠囊以18.43 g/kg體重灌胃大鼠無中毒、死亡癥狀，表明此產(chǎn)品LD50大于18.43 g/kg，按照《食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗急性毒性劑量分級標準》(GB 15193.3—2014)，此膠囊屬于無毒級。細菌回復突變試驗、小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗、小鼠精原細胞畸變試驗結果均為陰性，表明紅曲磷蝦油軟膠囊無遺傳毒性。28 d喂養(yǎng)試驗的大鼠各項檢驗指標均未發(fā)現(xiàn)明顯改變，說明紅曲磷蝦油軟膠囊安全無毒。下一步將對該產(chǎn)品的降血脂功能進行驗證，完善該產(chǎn)品的質量控制標準，為產(chǎn)品的開發(fā)提供科學依據(jù)。