飼糧大麥粉碎粒度對湖羊瘤胃微生物組成及肌肉脂肪酸的影響

馬曉文 ，李發(fā)弟 ，2，李飛 *，郭龍

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實驗室，甘肅民勤733300）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是包括共軛雙鍵的十八碳二烯酸同分異構(gòu)體組成的混合物［1］。諸多學(xué)者研究表明，CLA 具有抗癌［2］、抗糖尿?。?］、抗高血壓［4］、抗動脈粥樣硬化［5］、提高機(jī)體免疫機(jī)能和改變脂代謝［6］等眾多優(yōu)點。人類攝入的CLA 主要來源于反芻動物的肉和乳。CLA 可通過十八碳二烯酸經(jīng)反芻動物瘤胃微生物溶纖維丁酸弧菌生物加氫合成［7］。Martin 等［8］和 Kalscheur 等［9］在體外（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）研究均發(fā)現(xiàn)低的瘤胃pH 值會導(dǎo)致瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生改變進(jìn)而降低多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的生物加氫過程。同時，瘤胃中一些微生物數(shù)量發(fā)生改變，尤其是對pH 較敏感的纖維分解菌，隨著瘤胃pH 降低，瘤胃纖維分解菌如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量會快速減少［10］。而瘤胃pH 值主要受飼糧中瘤胃可降解淀粉含量的影響，進(jìn)而影響瘤胃中的生物氫化［11］及肌肉脂肪酸的含量。大麥（Hordeum vulgare）作為一種常見的谷物來源，其在瘤胃中的降解速率高于玉米（Zea mays），但降解過快會改變瘤胃微生物區(qū)系，甚至造成瘤胃酸中毒等健康問題，而谷物加工處理方式能夠影響谷物淀粉在瘤胃的降解率［12］，進(jìn)而改變瘤胃微生物區(qū)系以及肌肉脂肪酸的合成。因此，本試驗通過將大麥進(jìn)行不同粒度的粉碎，改變瘤胃可降解淀粉的含量，探究大麥不同粉碎粒度對瘤胃微生物區(qū)系組成及其肌肉脂肪酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗飼糧

參照我國農(nóng)業(yè)行業(yè)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）［13］，試驗飼糧配制能夠滿足（30.00±0.20）kg，平均日增重250 g 斷奶湖羊的營養(yǎng)需要。飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)成分Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 試驗設(shè)計與動物

于2019 年5-9 月，在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院民勤試驗基地開展試驗。選用54 只平均體重為（29.70±1.70）kg 的斷奶湖羊公羔，隨機(jī)分為3 個處理，每個處理18 個重復(fù)，每個重復(fù)1 只羊。大麥分別經(jīng)過2、3 和4 mm篩片粉碎，然后與其他飼料原料混勻后制成全混合顆粒飼糧。整個試驗期包括：預(yù)飼期7 d，正試期63 d 和采樣期1 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗開始前，對羊舍和試驗場地進(jìn)行嚴(yán)格清潔和消毒，試驗羊按照免疫程序嚴(yán)格注射疫苗、驅(qū)蟲及布病檢測。所有羊進(jìn)行單欄飼養(yǎng)，于每日08：00 和18：00 飼喂，自由采食和飲水，定期消毒和清潔衛(wèi)生。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 血液指標(biāo)的測定 正試期結(jié)束后，每組隨機(jī)選擇10 只體況相近的羊，晨飼前在頸靜脈處，用采血針采集全血置于2 mL 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，上下輕微顛倒，使抗凝劑與血液充分混勻，防止凝固，在2 h 內(nèi)完成血常規(guī)分析。參考周文靜［15］的方法，用全自動血細(xì)胞分析儀（IDEXX，ProCyte DX，USA）測定血液中的紅細(xì)胞總數(shù)（red blood cells，RBC）、血紅蛋白濃度（hemoglobin concentration，HGB）、紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）、平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）、血小板總數(shù)（platelets，PLT）、白細(xì)胞總數(shù)（white blood cells，WBC）、淋巴細(xì)胞計數(shù)（lymphocyte，LYMPH）、單核細(xì)胞計數(shù)（monocyte，MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)（eosinophil，EO）、嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)（neutrophil，NEUT）、嗜堿性粒細(xì)胞計數(shù)（basophil，BASO）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean red blood cell hemoglobin concentration，MCHC）、平均紅細(xì)胞體積（mean red blood cell volume，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean red blood cell hemoglobin content，MCH）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation of red blood cell distribution width，RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（coefficient of variation of red blood cell distribution width，RDW-CV）等血常規(guī)指標(biāo)檢測動物機(jī)體健康狀態(tài)。

1.4.2 瘤胃微生物DNA 的提取和分析 在正試期結(jié)束后，每組隨機(jī)選取10 只羊在晨飼后3 h 進(jìn)行屠宰，屠宰后采集瘤胃內(nèi)容物于50 mL 凍存管中，立即置于液氮中進(jìn)行速凍，后置于-80 ℃冰箱保存用于瘤胃微生物DNA的提取分析。參照試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，佐治亞州，美國）的說明書進(jìn)行瘤胃內(nèi)容物微生物DNA 的提取，通過熒光定量儀（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，美國）對普雷沃氏菌、反芻獸新月形單胞菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和總菌進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)在96 孔熒光定量板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為 20 μL，其中包括：10 μL SYBR Green Ⅱ，7.8 μL ddH2O，0.6 μL 上下游引物和 1 μL 瘤胃微生物DNA。擴(kuò)增反應(yīng)步驟為：94 ℃預(yù)變性 3 min，循環(huán) 1 次；94 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，此過程循環(huán)40 次；72 ℃終延伸 5 min，循環(huán) 1 次。并使用特定 16S rDNA 標(biāo)準(zhǔn)品對各個細(xì)菌進(jìn)行絕對定量［16］。參照金迪［17］的方法計算所有細(xì)菌的拷貝數(shù)。引物序列見表2［18-23］。

1.4.3 飼糧及肌肉脂肪酸的提取分析 屠宰時采集每只羊的背最長肌200 g，真空密封包裝置于-20 ℃保存。肌肉脂肪酸提取前，用冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10ND，寧波）凍干粉碎后稱取0.2 g 肌肉樣，提取方法參照蘭貴生［24］。利用氣相色譜儀（TRACE 1300，賽默飛，米蘭，意大利）分析各脂肪酸含量，選用SCION-FAME（100 m×0.25 m×0.20 μm，賽恩，新西蘭）色譜柱，測定條件為：進(jìn)樣量1 μL，分流比為50∶1，進(jìn)樣口和檢測器溫度分別為240 和 250 ℃，空氣、氫氣和補(bǔ)償氣（氮氣）的流率分別為 400、40 和 20 mL·min-1，50 ℃持續(xù) 4 min，然后以 13 ℃·min-1升至 175 ℃持續(xù) 27 min，再以 3 ℃·min-1升至 215 ℃持續(xù) 27 min，37 種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲基酯樣品（37 FAME 標(biāo)準(zhǔn)品，色譜科，美國）和OBCFA 標(biāo)準(zhǔn)品（BR2，Larodan Fine Chemicals，馬爾默，瑞典），并用二十一烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行樣品中脂肪酸的測定與分析。隨機(jī)采集3 個處理組的飼料樣各20 g，飼料樣脂肪酸提取和分析方法同肌肉樣，飼料樣脂肪酸組成見表3。

表3 試驗飼糧的脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of the experiment diets（g·kg-1）

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2019 整理數(shù)據(jù)，用IBM SPSS Statistics 25.0 進(jìn)行單因素 ANOVA 分析，采用 Duncan 法進(jìn)行多重比較，其中P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，0.05≤P＜0.10 表示有顯著的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧大麥粉碎粒度對湖羊血液指標(biāo)的影響

羊血液的 RBC、HGB、HCT、MPV、PLT、WBC、LYMPH、MONO、EO、NEUT、BASO、MCHC、MCV、MCH、RDW-SD 和RDW-CV 在不同處理間均無顯著差異（P＞0.05）（表 4）。

表4 飼糧大麥粉碎粒度對湖羊血液指標(biāo)的影響Table 4 Effects of barely particle size in diets on blood indexes of fattening Hu sheep

2.2 飼糧大麥粉碎處理對湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

大麥4 mm 粉碎組總菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量顯著高于3 mm 粉碎組（P＜0.05），反芻獸新月形單胞菌數(shù)量顯著低于2 和3 mm 粉碎組（P＜0.05），產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著高于2 mm 粉碎組（P＜0.05）。普雷沃氏菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量各組差異不顯著（P＞0.05）（表5）。

表5 飼糧大麥粉碎粒度對瘤胃微生物組成的影響Table 5 Effect of barely particle size in diets on rumen microorganisms composition（lg 16S rRNA copy number·g-1 rumen microbial）

2.3 飼糧大麥粉碎粒度對育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響

大麥 4 mm 粉碎組中的 C10：0、C12：0、C14：0 和 C14：1 的含量均顯著高于 2 mm 粉碎組（表 6），C18：2n-9t11t和 CLA 的含量顯著高于 3 mm 粉碎組（P＜0.05）。anteisoC15：0、C16：1、C18：2n6t 和 C18：2n-9c11t 的占比隨著粉碎粒度的增加有增加的趨勢（0.05≤P＜0.10）。

表6 飼糧大麥粉碎粒度對育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響Table 6 Effect of barely particle size in diets on muscle fatty acid composition of fattening Hu sheep

續(xù)表Continued Table

3 討論

3.1 飼糧大麥粉碎處理對育肥湖羊血液指標(biāo)的影響

血液成分的變化代表著動物健康狀態(tài)，能夠反映部分疾?。?5］。飼喂高谷物飼糧能顯著提高反芻動物的生產(chǎn)性能，同時也會使瘤胃可降解淀粉含量增加，引起亞急性瘤胃酸中毒（subacute rumen acidosis，SARA），進(jìn)而引起機(jī)體炎癥反應(yīng)［26-28］，且本試驗大麥淀粉在瘤胃中降解速度快，更易造成動物機(jī)體患?。?9］。因此，血常規(guī)的檢測是有必要的，本研究結(jié)果顯示血常規(guī)指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)［15］。白細(xì)胞能夠反映動物的免疫能力，包括單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞［30］，對于維持正常的血液循環(huán)和疾病診斷有重要的意義［31］。本試驗結(jié)果顯示，3 組間血液WBC、MONO、EO、NEUT 和LYMPH 無顯著差異，表明大麥作為淀粉來源時，不同粉碎處理對育肥湖羊機(jī)體免疫功能沒有顯著影響。血液RBC 和HGB 可以作為判斷機(jī)體是否貧血的指標(biāo)［32］，反映動物機(jī)體血液運輸氧氣和二氧化碳的能力，PLT 的數(shù)量和功能與機(jī)體血液凝血系統(tǒng)相關(guān)，在維持血液循環(huán)中具有重要意義［33］。在本試驗中，RBC、HGB 和PLT 均無顯著差異，可知大麥淀粉來源的飼糧對湖羊機(jī)體的血液氧化還原能力和凝血功能影響不顯著。馮躍進(jìn)［34］指出血液RDW 可反映紅細(xì)胞的變異程度，血液MCHC、MCH 和MCV 被稱為判定貧血的3 項指標(biāo)，較低的MCHC、MCH、MCV 和較高的RDW，可以鑒定為缺鐵性貧血。本試驗結(jié)果顯示，飼糧處理不會使湖羊機(jī)體出現(xiàn)貧血癥狀?？梢姡暭Z大麥粉碎粒度對湖羊血常規(guī)指標(biāo)無影響。

3.2 飼糧大麥粉碎處理對育肥湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

大麥不同粒度的粉碎會改變谷物和瘤胃微生物及酶的接觸面積，從而改變瘤胃可降解淀粉的含量，進(jìn)而改變瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)［11］，最終引起瘤胃微生物組成的變化，影響發(fā)酵速度和終產(chǎn)物的形成［35］。Plaizier 等［10］發(fā)現(xiàn)谷物粉碎處理飼喂奶牛誘導(dǎo)SARA 后，瘤胃pH 降低，瘤胃微生物中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌等纖維分解菌的含量明顯下降，相反，反芻獸新月形單胞菌和普雷沃氏菌等淀粉分解菌含量增加［36］。而在本試驗中，4 mm 粉碎組的瘤胃微生物中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌含量增加，反芻獸新月形單胞菌的含量降低，這說明粗粉碎大麥可能會通過降低瘤胃可降解淀粉的含量而降低動物患SARA 的風(fēng)險。Andrés 等［37］將玉米進(jìn)行2 和6 mm 粉碎飼喂斷奶羔羊，2 mm 粉碎組飼喂羔羊的瘤胃中普雷沃氏菌等淀粉分解菌含量增加。本試驗2 和3 mm 粉碎組淀粉分解菌反芻獸新月形單胞菌數(shù)量增加與此一致。Carlson 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，粒度的增加可能會延長營養(yǎng)物質(zhì)崩解所需的時間，并延遲微生物接觸可發(fā)酵有機(jī)物的時間，粒徑的增加是降低發(fā)酵速率和瘤胃酸中毒風(fēng)險的有效方法。本試驗中，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌等纖維分解菌的數(shù)量在4 mm 粉碎組顯著增加，這可能是因為4 mm 粉碎組中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）消化率顯著高于其他處理［39］，促進(jìn)了纖維分解菌的生長。

3.3 飼糧大麥粉碎處理對育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響

本試驗中，4 mm 粉碎組能夠提高 C10：0、C12：0 和 C14：0 等偶數(shù)碳脂肪酸的含量。雙金等［40］研究表明羊肉的膻味隨體脂中C10：0 含量的增加而加重，因此4 mm 粉碎組可能會增加羊肉的膻味。有研究表明延長丙酸和戊酸碳鏈可以形成直鏈奇數(shù)碳脂肪酸，延長乙酸主要得到偶數(shù)碳脂肪酸［41］。而在本試驗中，2、3 和4 mm 粉碎組乙酸含量分別為 49.72、49.58 和 54.47 mmol·L-1，各組間無顯著差異［39］，4 mm 粉碎組僅在數(shù)值上有增長的趨勢，具體原因有待進(jìn)一步驗證。瘤胃中生物氫化作用是產(chǎn)生CLA 的基礎(chǔ)，而溶纖維丁酸弧菌是生物氫化的優(yōu)勢菌群，在本試驗中4 mm 粉碎組的溶纖維丁酸弧菌數(shù)量顯著增長，這可能促進(jìn)了生物加氫，與Vlaeminck 等［42］的結(jié)果相似。動物采食谷物含量過高的飼糧會導(dǎo)致瘤胃氫化途徑發(fā)生改變［43］，主要是改變了在瘤胃生物氫化過程中起關(guān)鍵作用的溶纖維丁酸弧菌數(shù)量，使飼糧 cis-9，cis-12 C18：2n-6 氫化生成 cis-9，trans-11 C18：2 和 trans-11 C18：1 途徑轉(zhuǎn)變成了生成trans-10，cis-12 C18：2 和trans-10 C18：1。這些結(jié)果說明瘤胃中纖維分解菌通過影響微生物氫化而改變瘤胃液及內(nèi)容物中脂肪酸的組成，進(jìn)而導(dǎo)致動物產(chǎn)品中脂肪酸組成發(fā)生變化［44］。亞麻酸和亞油酸等PUFA 不完全氫化可以合成 CLA［45］，在本試驗中亞麻酸和亞油酸含量無顯著差異，但 C16：1、C18：2n-9c11t 等 PUFA 的含量有增加的趨勢，這也影響了CLA 的合成。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，大麥4 mm 粉碎組中纖維分解菌數(shù)量增加，反芻獸新月形單胞菌數(shù)量減少，肌肉脂肪酸中CLA 含量增加，因此，4 mm 粉碎處理大麥對湖羊瘤胃微生物區(qū)系和肌肉脂肪酸CLA 合成的影響效果最佳。