祁連山不同類型草地土壤細(xì)菌群落特征研究

趙文 ，尹亞麗 ，李世雄 ，2*，劉燕 ，劉晶晶 ，董怡玲 ，蘇世鋒 ，吉凌鶴

（1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016；2. 青海大學(xué)三江源區(qū)高寒草地生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810016；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

祁連山位于青藏、蒙新、黃土三大高原交匯的生態(tài)脆弱地帶，在維持動(dòng)植物物種多樣性和涵養(yǎng)內(nèi)陸河水源方面發(fā)揮著不可替代的作用，被稱為架構(gòu)在西北地區(qū)生態(tài)安全屏障的“生態(tài)之脊”［1］。草地生態(tài)系統(tǒng)是祁連山主要的生態(tài)系統(tǒng)，在溫度和水分因子的驅(qū)動(dòng)下，祁連山地區(qū)從低海拔到高海拔分布著10 種不同類型的草地，呈現(xiàn)出明顯的分異和組合［2-3］。不同類型草地的存在不僅對(duì)當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，亦在維持我國(guó)草地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和多樣性等方面占有不可或缺的分量［4］。然而近幾十年，尤其是從20 世紀(jì)90 年代實(shí)行的草場(chǎng)承包到戶，導(dǎo)致了大面積的過度放牧，造成了草地退化、水土流失、嚙齒動(dòng)物大量繁殖以及一系列生態(tài)系統(tǒng)失衡問題［5-6］。其中高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)氣候寒冷，屬多年凍土，是生物多樣性變化的敏感區(qū)域［7］；沼澤化草甸是介于草甸與沼澤之間的過渡類型，是易受環(huán)境干擾的生態(tài)脆弱區(qū)［8］。在過度放牧等因素的影響下，部分高寒草甸出現(xiàn)大面積裸斑塊，優(yōu)勢(shì)物種減少，形成以毒雜草為主的黑土灘退化草地，失去了原有的生態(tài)功能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［9］。建植人工草地是快速恢復(fù)黑土灘最有效的辦法，植被恢復(fù)的同時(shí)對(duì)土壤微生物區(qū)系產(chǎn)生影響［10］。土壤微生物與生態(tài)系統(tǒng)功能密不可分，在維持地上植被多樣性和土壤養(yǎng)分平衡中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)土壤微生物是動(dòng)態(tài)變化的自組織系統(tǒng)，通過遺傳維持其組成和結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，通過變異適應(yīng)環(huán)境干擾［11-12］。因此，從微生物的數(shù)量組成和物種豐度了解土壤微生物系統(tǒng)［13］，對(duì)了解草地微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要的意義。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與碳、氮循環(huán)，有機(jī)化合物分解及能量傳輸、運(yùn)送等多種過程，對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和可持續(xù)性方面有重要的作用［14］。細(xì)菌可以提供本地化參照系中特定的生態(tài)系統(tǒng)指標(biāo)，用以評(píng)估土地價(jià)值［15］。因此，探究細(xì)菌群落的多樣性及群落結(jié)構(gòu)，對(duì)評(píng)價(jià)和調(diào)控草地生態(tài)功能具有參考價(jià)值。已有研究表明，環(huán)境因素驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落在全球尺度上的分布，呈現(xiàn)出不同生物地理模式［16］，劉怡萱等［17］綜合比較青藏高原區(qū)域大尺度，發(fā)現(xiàn)東部、中部和東北部地區(qū)細(xì)菌群落的豐富度和多樣性較高，西部以及西北部地區(qū)較低；Wang 等［18］對(duì)新疆和內(nèi)蒙古橫跨3700 km 的多種草地類型長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，大區(qū)域尺度下微生物共存網(wǎng)絡(luò)主要受年均降水量影響。也有研究指出土壤細(xì)菌隨生態(tài)類型變化也出現(xiàn)相應(yīng)改變，青藏高原由東向西從農(nóng)用地到高寒草甸，細(xì)菌群落出現(xiàn)顯著的差異［19］。但是區(qū)域大尺度下影響微生物群落的因素眾多，且各因素間綜合作用對(duì)于微生物影響也未可知，而小區(qū)域生境內(nèi)環(huán)境因子的影響會(huì)顯著降低，這將有助于了解土壤細(xì)菌群落的組成［20］。因此，本研究以祁連山區(qū)高寒草甸、沼澤化草甸和人工草地為對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3 種類型草地土壤細(xì)菌群落特征進(jìn)行分析，闡明土壤細(xì)菌物種組成及群落結(jié)構(gòu)等在草地類型間的異同點(diǎn)，揭示土壤環(huán)境因子與細(xì)菌群落間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，為祁連山草地生態(tài)環(huán)境保護(hù)及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

研究地位于青海省祁連縣默勒鎮(zhèn)瓦日尕村（37°56′48.60″N，100°13′13.80″E，海拔約3650 m），屬高原大陸性氣候，冷季長(zhǎng)、暖季短，年均溫-1.7 ℃，1 月平均氣溫-14.8 ℃，7 月平均氣溫9.8 ℃，氣溫日較差大，干濕分明，氣溫和降水垂直變化明顯，雨熱同期，年平均降水量為614.8 mm。該區(qū)光能資源豐富，日照時(shí)間長(zhǎng)，輻射強(qiáng)，年蒸發(fā)量1162.3 mm［21］。草地植被主要以高寒草甸為主，其優(yōu)勢(shì)種主要有矮嵩草（Kobresia humilis）、垂穗披堿草（Elymus nutans）、草地早熟禾（Poa pratensis）、高山嵩草（Kobresia pygmaea）等，植被蓋度和物種豐富度見表 1。人工草地主要以草地早熟禾、芒洽草（Koeleria litvinowii）、中華羊茅（Festuca sinensis）、冷地早熟禾（Poa crymophila）等為主。沼澤化草甸是苔草型沼澤化草甸，優(yōu)勢(shì)物種有青藏苔草（Carex moorcroftii）、線葉嵩草（Kobresia capillifolia）、矮嵩草等。

表1 不同草地類型植被蓋度及物種豐富度Table 1 Vegetation coverage and species richness in different grassland types

1.2 樣地設(shè)置與測(cè)定方法

在青海省祁連縣默勒鎮(zhèn)選擇3 塊面積分別約為50 hm2的高寒草甸、沼澤化草甸及人工草地為試驗(yàn)樣地，樣地間隔約5 km，各處理樣地設(shè)4 個(gè)試驗(yàn)小區(qū)為重復(fù)，共12 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積約1200 m2。高寒草甸和沼澤化草甸均是原生草甸，分別為春季牧場(chǎng)（4-12 月放牧）和夏季牧場(chǎng)（7-9 月放牧）。人工草地是高寒草甸退化為黑土灘，經(jīng)過深翻、耙平、施肥（一次性施 N 肥 61.5 kg·hm-2、P 肥 68.9 kg·hm-2）、撒種（播量 15 kg·hm-2）、覆土、鎮(zhèn)壓等農(nóng)藝措施建植的混播人工草地，建植周期為4 年，返青期（4-6 月）完全禁牧，冬季放牧利用（每年11 月-次年4月），各草地放牧強(qiáng)度相同。

1.3 樣品采集及測(cè)定方法

2018 年8 月中旬在每小區(qū)隨機(jī)選取4 個(gè)面積為50 cm×50 cm 的樣方，對(duì)植被群落特征進(jìn)行調(diào)查。用直徑3.5 cm 的土鉆，每小區(qū)隨機(jī)取5～8 點(diǎn)，采集0～10 cm 土樣，每個(gè)小區(qū)混合為一個(gè)土樣，并過2 mm 的篩，充分混勻后分成兩份，1 份室內(nèi)陰干用于土壤理化性質(zhì)分析。采用酸度計(jì)電位法常溫下（土水比1∶5）測(cè)定土壤pH；采用烘干稱重法測(cè)定土壤含水量（soil water content，SWC）；參照楊劍虹等［22］的測(cè)定方法，采用硫酸銅-硫酸鉀（10∶1）-濃硫酸消解，凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮（total nitrogen，TN）含量，采用氯化鉀浸提法測(cè)定硝態(tài)氮（nitrate nitrogen，NN）和氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，AN）含量；采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定全磷（total phosphorus，TP）含量；采用H2SO4-K2Cr2O7外加熱，硫酸亞鐵滴定測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)碳（total organic carbon，TOC）含量。

另一份土壤樣品裝于自封袋，夾棉塞透氣，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，裝入10 mL 離心管，干冰運(yùn)輸至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序和生物信息服務(wù)在Illumina 250 PE 平臺(tái)完成。土壤DNA 用HiPure Soil DNA kits 試劑盒按照步驟提取，獲得DNA 總樣在Nanorop 微量分光光度計(jì)（Nanorop 2000，美國(guó)）上進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。同時(shí)對(duì)核酸樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其目的是檢驗(yàn)核酸樣本的完整性，是否發(fā)生降解，是否有蛋白等污染。PCR 擴(kuò)增是 用 帶 有 barcode 的 特 異 引 物 擴(kuò) 增 16S rDNA 的 V3～V4區(qū) ，引 物 序 列 為 341F（CCTACGGGN GGCWGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）［23］。PCR 反應(yīng)體系［24］：5 μL KOD 緩沖液（10×），1 μL KOD 高保真 DNA 聚合酶，5 μL（2 mmol·L-1）dNTPs，正向和反向引物各 1.5 μL（10 μmol·L-1），加入適當(dāng)?shù)哪０?，使用一定量的ddH2O 將反應(yīng)體系總體積擴(kuò)充至50 μL 。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min 后進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98 ℃變性10 s，62～66 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后68 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸純化試劑盒（AMPure XP Beads）進(jìn)行產(chǎn)物純化，純化后使用Qubit（Qubit 3.0，美國(guó)）進(jìn)行定量。使用AMPure XP Beads 對(duì)第 2 輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行定量，由廣州基迪奧生物科技有限公司Illumina 250 PE 平臺(tái)完成測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到原始序列（raw reads）之后，對(duì)低質(zhì)量序列（reads）進(jìn)行過濾，然后進(jìn)行組裝和再過濾，用Uparse 軟件對(duì)所有樣品的全部有效序列聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units）結(jié)果。Uparse 在構(gòu)建OTUs 的過程中會(huì)選取代表性序列（OTUs 中豐度最高的那條Tag 序列），將這些代表性序列集合用 RDP 分類器的 NBA 算法，與 Silva（Quast，2013）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋［24］（設(shè)定置信度的閾值為 0.8～1.0）。

Simpson 指數(shù)（DS）是樣本中物種的豐富度與均勻度的綜合指標(biāo)；Shannon 指數(shù)（H）是物種豐富度、均勻度的體現(xiàn)，是對(duì)群落結(jié)構(gòu)的綜合反映；Chao1 指數(shù)是用于估算樣本物種總量的計(jì)算值。

式中：S 表示物種種類總數(shù)；Pi表示樣品中屬于第i種的個(gè)體比例，如樣品總個(gè)體為N，第i種個(gè)體數(shù)為ni，則Pi=ni/N；Sobs為觀察到的物種數(shù)，也就是測(cè)序分析得到的物種數(shù)；F1是樣本中數(shù)量為1 的物種數(shù)；F2是樣本中數(shù)量為2 的物種數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 對(duì)植被、土壤理化性質(zhì)、微生物多樣性指數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差比較，結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。用Anosim（analysis of similarity）非參數(shù)檢驗(yàn)法檢驗(yàn)組間差異，用矩陣相關(guān)性分析土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落之間的關(guān)系，所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2006 整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

3 種類型草地0～10 cm 土壤理化性質(zhì)均表現(xiàn)出不同程度的差異（表2），其中沼澤化草甸土壤全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)碳含量、含水量和硝態(tài)氮含量均顯著高于高寒草甸和人工草地（P＜0.05）；人工草地與高寒草甸間除含水量和硝態(tài)氮含量表現(xiàn)顯著差異外，其他指標(biāo)均未表現(xiàn)顯著差異。

表2 土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Basic soil physical and chemical properties in the three investigated grassland（n=4）

2.2 不同草地類型土壤細(xì)菌群落OTU 組成及結(jié)構(gòu)

在祁連山高寒草甸、人工草地和沼澤化草甸土壤中共得到有效序列1022446 條，平均每個(gè)樣本的有效序列為85203 條。以97%的一致性將有效序列聚類為OTU，3 種草地共檢測(cè)到60905 條，其中高寒草甸、人工草地、沼澤化草甸的 OTU 均值分別是 4917、5233、5075 條。

稀釋曲線分析顯示，當(dāng)抽取的序列數(shù)達(dá)到25000時(shí)，曲線趨向于平緩，說明測(cè)序的數(shù)據(jù)量基本合理，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的OTU 貢獻(xiàn)不大（圖1）。韋恩分析顯示（圖2），在OTU 水平上，高寒草甸的特異性細(xì)菌 OTU 數(shù)（744）占總 OTU 的 12.95%；人工草地中細(xì)菌OTU 數(shù)（1016）占17.68%；沼澤化草甸細(xì)菌OTU 數(shù)（1245）占21.67%。此外，高寒草甸和人工草地共有細(xì)菌OTU 數(shù)（2211）占38.48%；人工草地和沼澤化草甸共有特異OTU 數(shù)（1636）占28.47%；高寒草甸和沼澤化草甸共有細(xì)菌OTU 數(shù)（1751）占30.47%，3 個(gè)草地共有細(xì)菌 OTU 數(shù)（1429）占24.87%。

圖1 不同類型草地土壤細(xì)菌稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of microbial communities in different grassland types

圖2 不同類型草地土壤細(xì)菌OTU 韋恩分析Fig. 2 Venn diagram of bacterial communities in different grassland types based on OTUs abundance

2.3 不同類型草地土壤細(xì)菌群落多樣性分析

對(duì)3 種草地土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，評(píng)估不同群落的均勻度和豐富度（表3）。Shannon 多樣性指數(shù)在人工草地最高，高寒草甸次之，沼澤化草甸最低，但差異不顯著；Simpson 指數(shù)在不同草地類型中差異不顯著，具體表現(xiàn)為高寒草甸＞沼澤化草甸＞人工草地；Chao1 指數(shù)表現(xiàn)為人工草地顯著高于其他兩類草地（P＜0.05），且高寒草甸顯著高于沼澤化草甸（P＜0.05）。

表3 不同草地類型土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)Table 3 Richness and diversity indices of bacteria communities in different grassland types

2.4 不同草地類型土壤細(xì)菌群落PCoA 分析與Anosim 分析

基于Unweight unifrac 距離對(duì)3 種草地土壤細(xì)菌群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），主坐標(biāo) 1（PCo1）與主坐標(biāo) 2（PCo2）對(duì) 3 種類型草地土壤細(xì)菌群落差異的解釋率分別為21.70%、12.18%，累計(jì)貢獻(xiàn)為33.88%。進(jìn)一步的Anosim 分析結(jié)果表明3 種草地土壤細(xì)菌群落差異顯著（r=1.000，P=0.001，圖 3）。

圖3 不同類型草地土壤細(xì)菌群落PCoA 分析Fig. 3 PCoA analysis of bacterial communities from different grassland types

2.5 不同類型草地土壤細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)變化

從3 種不同類型草地土壤中共檢測(cè)到相對(duì)豐度均大于1%的細(xì)菌分屬于10 個(gè)門（圖4），其分別占高寒草甸、人工草地和沼澤化草甸土壤細(xì)菌總數(shù)的94.61%、95.51% 和94.96%。3 種類型草地均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為主要類群。其中沼澤化草甸土壤細(xì)菌群落的變形菌門類群顯著高于高寒草甸和人工草地（P＜0.05）；而沼澤化草甸的酸桿菌門和放線菌門豐度最低，顯著低于其他兩類草地；浮霉菌門在各草地間差異不顯著。

圖4 不同類型草地土壤細(xì)菌群落門水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria soil sample of different grassland types at the phylum level

在3 種類型草地土壤細(xì)菌屬水平上共得到369 個(gè)細(xì)菌屬水平類群，其中相對(duì)豐度大于1%的類群有18 個(gè)（圖5，表4）。高寒草甸相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌類群有5 個(gè)，主要以RB41（6.57%）、鞘氨醇單胞菌屬（3.43%）、慢生根瘤菌屬（2.63%）等為主要類群；人工草地相對(duì)豐度大于1%的類群有7 個(gè)，主要以鞘氨醇單胞菌屬（7.91%）、RB41（5.96%）、芽單胞菌屬（1.53%）等為主要類群；沼澤化草甸相對(duì)豐度大于1%的類群有6 個(gè)，主要以RB41（3.90%）、硝化螺旋菌屬（2.09%）、鞘氨醇單胞菌屬（1.68%）等為主要類群。對(duì)不同類型草地土壤細(xì)菌屬水平差異分析發(fā)現(xiàn)RB41、CL500-29_marine_group、中慢生根瘤菌屬、土微菌屬、類芽孢桿菌屬和慢生根瘤菌屬在高寒草甸顯著富集（P＜0.05）；鞘氨醇單胞菌屬、Subgroup_10、芽單胞菌屬、MND1、出芽菌屬、Ellin6067 在人工草地顯著富集（P＜0.05）；硝化螺旋菌屬、Massilia、Haliangium、假單胞菌屬在沼澤化草甸顯著富集（P＜0.05，圖5）。

圖5 不同類型草地土壤細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of soil bacterial community structure in different types of grassland at the genus level

表4 不同草地土壤細(xì)菌屬水平群落信息Table 4 Information regarding the bacterial community at the genus level in different grassland types

2.6 土壤環(huán)境因子與細(xì)菌群落的相關(guān)性分析

采用Mantel tests 分析土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的相關(guān)性，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與有機(jī)質(zhì)碳、全磷、土壤含水量、硝態(tài)氮、全氮顯著相關(guān)（P＜0.05，表5）。

表5 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性Table 5 Correlation between bacterial communities and soil properties

用顯著相關(guān)的6 個(gè)土壤理化因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）。CCA 二維排序圖可以直觀地給出研究對(duì)象與環(huán)境變量之間的關(guān)系，排序軸與箭頭連線夾角表示環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性，夾角越小表明關(guān)系越密切，而箭頭連線表示環(huán)境因子與研究對(duì)象相關(guān)程度的大小，連線越短，相關(guān)性越小，反之越大。土壤有機(jī)質(zhì)碳、全磷和含水量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響最大（P=0.001，圖 6，表 6），pH 對(duì)細(xì)菌群落無顯著影響。同時(shí)，沼澤化草甸與其他兩類草地有明顯的分異，土壤細(xì)菌主要聚類于土壤有機(jī)質(zhì)碳、全磷、含水量高的區(qū)域，且沼澤化草甸土壤細(xì)菌群落受環(huán)境因子的影響大于其他兩類草地。

表6 土壤理化性質(zhì)與門水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相關(guān)性Table 6 Correlation between properties and soil dominant bacteria at the phylum level

圖6 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子間的典范對(duì)應(yīng)分析Fig.6 Canonical correspondence analysis of bacterial communities with basic soil physical and environmental factors

3 討論

草地植被-土壤-微生物的作用與反饋是貫穿草地生態(tài)系統(tǒng)的重要紐帶，植物通過凋落和分泌為土壤微生物提供營(yíng)養(yǎng)，促使植物和微生物之間協(xié)同進(jìn)化［25］，土壤微生物通過選擇植被間接反映生態(tài)系統(tǒng)在演替過程中土壤和植被群落的演替方向。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)祁連山3 種草地類型土壤細(xì)菌群落變化進(jìn)行探究，結(jié)果表明不同草地土壤細(xì)菌群落差異顯著，多樣性分析顯示人工草地Chao1 指數(shù)顯著高于高寒草甸和沼澤化草甸（P＜0.05）。這可能是微生物對(duì)草地植被變化的響應(yīng)，本研究中人工草地為建植4 年的草地，正處于人工草地暫穩(wěn)態(tài)的演替階段［26］，植被的穩(wěn)態(tài)可能重新塑造了適應(yīng)于人工草地的微生物群落區(qū)系，Zhu 等［27］的研究表明，人工草地通過良好的根系網(wǎng)絡(luò)發(fā)育和凋落物積累改善了土壤生境，導(dǎo)致微生物群落發(fā)生變化。伍文憲等［28］在川西北以天然草地和兩種人工草地為研究對(duì)象，結(jié)果表明人工草地與天然草地的細(xì)菌Chao1、Shannon 指數(shù)無顯著性差異，本研究的結(jié)論與之相反，可能是由于人工草地地上植被不同及區(qū)域獨(dú)特性造成。本研究中高寒草甸的Chao1 指數(shù)顯著高于沼澤化草甸，這可能與沼澤化草甸的性質(zhì)有關(guān)，沼澤化草甸處于向草甸過渡末期，加之人為因素的影響，原來積累的養(yǎng)分流失，微生物數(shù)量也會(huì)相應(yīng)地減少［29］，另一方面植被的類型及其多樣性也可能影響微生物的多樣性，高寒草甸和沼澤化草甸植被物種組成有差異，造成對(duì)土壤表面的覆蓋程度不相同，同時(shí)土壤溫度、濕度的差異，加之不同植被群落結(jié)構(gòu)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、枯枝落葉物多少有別，從而影響了土壤微生物數(shù)量和活動(dòng)狀況。

進(jìn)一步分析不同草地類型土壤細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)本研究中3 種草地均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為優(yōu)勢(shì)類群，與絕大多數(shù)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門基本相同［30］。王穎等［31］以固原半干旱典型草原為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門是土壤細(xì)菌的主要類群；Zhang 等［32］在青藏高原北麓河流域以草甸、草原為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要由變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門組成；Li 等［33］對(duì)西藏高寒草甸土壤細(xì)菌的研究指出無論高寒草地退化程度如何，變形菌門，放線菌門和酸桿菌門都是主要細(xì)菌類群，本研究結(jié)果與其基本一致。表明區(qū)域大尺度上土壤細(xì)菌群落的組成和分布有差異，但細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群沒有顯著的差異。Chu 等［34］也探討了區(qū)域尺度和環(huán)境因子對(duì)微生物的影響，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子是區(qū)域微生物分布的主要驅(qū)動(dòng)力。而本研究中植被的差異是最有可能造成微生物差異的環(huán)境原因，植被類型不同影響土壤理化性質(zhì)，而土壤微生物受理化性質(zhì)的影響出現(xiàn)地域性特點(diǎn)［35-36］。本研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門是各草地豐度最大類群，這與Bazylinski 等［37］的研究一致，證實(shí)了變形菌門是陸地土壤生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)類群。差異性分析顯示沼澤化草甸土壤細(xì)菌群落的變形菌門豐度顯著高于高寒草甸和人工草地，進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明變形菌門與有機(jī)質(zhì)碳、全磷和含水量極顯著正相關(guān)（表6），這可能是沼澤化草甸生態(tài)脆弱的原因，超過1/3 的OTU 來源于變形菌門，群落組成的單一化可能導(dǎo)致其聯(lián)系較為緊密，對(duì)外界的抵抗能力反而較弱［38］。而酸桿菌門和放線菌門在沼澤化草甸最低，并與土壤有機(jī)質(zhì)碳、土壤含水量和氨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明放線菌門和酸桿菌門易在偏貧瘠的地方富集。

祁連山3 種類型草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤有機(jī)質(zhì)碳、全磷和含水量極顯著正相關(guān)。朱平等［39］分析了祁連山中段墊狀植被、高寒草甸、沼澤草甸和高寒灌叢植被群落，發(fā)現(xiàn)土壤pH 是影響土壤細(xì)菌群落分布最主要的因子，本研究結(jié)果與之相反。pH 是大尺度上造成微生物群落差異的主要原因，張于光等［40］認(rèn)為pH 是影響微生物海拔分布格局的主要原因。當(dāng)pH 偏離中性，微生物群落會(huì)受到環(huán)境脅迫壓力［7］。本研究pH 介于6.8～7.3，趨于中性，故對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無明顯影響。在本研究中有機(jī)質(zhì)碳、全磷和含水量是微生物群落差異的驅(qū)動(dòng)因子，也是造成沼澤化草甸與高寒草甸、人工草地微生物群落差異的主要原因。土壤有機(jī)碳與植被物種組成有關(guān)，不同的物種凋落物、根系分泌物為微生物提供了不同的碳源，由此導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異；其次含水量對(duì)細(xì)菌群落有影響，沼澤化草甸夏季雨后覆水，旱季淹水環(huán)境逐漸改善，但土壤通透性差且氧氣含量低，盡管高含量的土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、硝態(tài)氮和適宜的pH 值為土壤細(xì)菌提供良好的生存條件，但該環(huán)境不利于好氧微生物的生長(zhǎng)。如在本研究中沼澤化草甸細(xì)菌屬水平上顯著富集的硝化螺旋菌屬、假單胞菌屬是對(duì)水生植物重要的細(xì)菌，參與多種生態(tài)反應(yīng)。而在高寒草甸富集的細(xì)菌RB41、中慢生根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬是變形菌門的一種與寄主植物共生的細(xì)菌，能將游離銨（NH4+）固定［41］。一般高寒草甸中豆科類物種豐度較大，可能是造成此類菌富集的主要原因。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定并揭示了祁連山高寒草甸、人工草地、沼澤化草甸土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，探討了土壤理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌群落的影響。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌門水平上，3 地均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為主要類群，屬水平上表現(xiàn)出不同類型草地細(xì)菌富集類型不同。PCoA 分析顯示3 種草地類型細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有差異，土壤有機(jī)質(zhì)碳、全磷、土壤含水量與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)極顯著相關(guān)（P＜0.01），是影響3 種草地類型土壤細(xì)菌分布的主要因素。