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    30 份紅三葉種質(zhì)資源耐銅性綜合評(píng)價(jià)

    2021-12-17 01:26:56張鶴山高秋張婷婷陸姣云田宏熊軍波劉洋
    草業(yè)學(xué)報(bào) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:紅三葉胚根發(fā)芽率

    張鶴山 ,高秋 ,張婷婷 ,陸姣云 ,田宏 ,熊軍波 ,劉洋 *

    (1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,湖北武漢430064;2. 全國(guó)畜牧總站牧草種質(zhì)資源保存中心,北京100125)

    隨著城鎮(zhèn)工業(yè)化的發(fā)展,重金屬污染帶來的環(huán)境問題日益突出[1-2]。銅作為植物生長(zhǎng)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素,參與植物各種基本代謝活動(dòng)[3],然而,過量的銅會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[4]。通常,當(dāng)植物組織銅含量≥20 mg·kg-1干物質(zhì)(dry matter,DM)會(huì)產(chǎn)生毒害作用,將導(dǎo)致植物形態(tài)、解剖、生理等方面的改變,從而降低植物的產(chǎn)量和質(zhì)量[5-6]。近幾十年,由于采礦、冶煉、廢物處理、農(nóng)藥、殺菌劑和大氣沉降等原因,銅被廣泛釋放到環(huán)境中[7-10]。許多地區(qū)的土壤受到了銅的輕度或中度污染[11],如湖北已廢棄3000 多年的銅綠山古冶煉渣礦的總銅含量達(dá)7789 mg·kg-1[12],浙江哩鋪銅礦區(qū)土壤中銅含量超過 700 mg·kg-1[13]。在一些果園,銅在土壤中積累得越來越多,山東省某蘋果園的土壤銅濃度在2008-2014 年以每年1.37~1.45 mg·kg-1的速率遞增[14-16],巴西南部(里約熱內(nèi)盧)的一處葡萄園,土壤銅的最大濃度值高達(dá)3200 mg·kg-1。這些銅污染的土壤不僅造成農(nóng)業(yè)糧食減產(chǎn),而且會(huì)威脅人類的身體健康[17-18]。

    國(guó)內(nèi)外開展了許多環(huán)境中的銅修復(fù)研究[19]。目前,物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)策略已被人們普遍采用,然而,高昂的成本和低下的效率限制了物理和化學(xué)修復(fù)措施的應(yīng)用[20],而植物修復(fù)技術(shù)因利用植物及其根際微生物對(duì)土壤污染物的吸收、提取、分解、轉(zhuǎn)化和固定的特點(diǎn),被學(xué)術(shù)界稱為“綠色修復(fù)”,近年來備受關(guān)注。一些耐銅性或能夠富集Cu2+的植物如海洲香薷(Elsholtzia harchowensis)[21]和蕨類植物[22]能夠在高土壤銅含量環(huán)境中正常生長(zhǎng),已經(jīng)在土壤銅污染修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用。許多學(xué)者也開展了牧草類物種如巨菌草(Pennisetumsp.)[23]、葦狀 羊 茅(Festuca arundinacea)[24]、蘇 丹 草(Sorghum sudanense)[25]、雜 交 狼 尾 草(Pennisetum americanum×P.purpureum)[26]、紫花苜蓿(Medicago sativa)[27-28]、紫云英(Astragalus sinicus)[29]等草種的耐銅性研究,并被用于土壤重金屬污染的修復(fù)。

    我國(guó)湖北、江西、湖南等地區(qū)有大量的銅尾礦,修復(fù)這些銅污染土壤成為生態(tài)保護(hù)建設(shè)的重要內(nèi)容。紅三葉(Trifolium pratense)是豆科車軸草屬多年生草本植物,廣泛栽培于長(zhǎng)江流域及西南地區(qū),是家畜重要的蛋白來源,也具有生長(zhǎng)快、根系發(fā)達(dá)、地上部生物量高等潛在的植物修復(fù)能力。研究發(fā)現(xiàn),紅三葉可以在Cu2+含量為1200 mg·kg-1的土壤中正常生長(zhǎng),表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐銅脅迫能力[30],具有在銅礦區(qū)生產(chǎn)應(yīng)用的潛力。鑒于此,本研究以來自國(guó)內(nèi)外的不同紅三葉種質(zhì)為材料,在萌發(fā)期和苗期研究其生長(zhǎng)發(fā)育特性并開展耐銅性綜合評(píng)價(jià),以期篩選出能夠在銅尾礦或銅污染土壤正常生長(zhǎng)的優(yōu)良種質(zhì)材料,為耐銅性紅三葉新品種選育及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    30 份紅三葉種質(zhì)材料由全國(guó)畜牧總站牧草種質(zhì)資源保存中心提供。材料信息見表1。

    表1 供試材料信息Table 1 Information of red clover germplasm resources

    1.2 試驗(yàn)方法

    萌發(fā)期脅迫試驗(yàn)在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行,試驗(yàn)期12 d(2021 年1 月2 日-14 日),培養(yǎng)箱溫度為(25±1)℃,光照設(shè)置 16 h 黑暗/8 h 光照交替進(jìn)行。試驗(yàn)處理設(shè)置 4 個(gè) Cu2+脅迫濃度:0.5、2.0、4.0 和 8.0 mmol·L-1,以去離子水處理為對(duì)照,每個(gè)處理4 次重復(fù),每個(gè)重復(fù)100 粒種子。采用濾紙發(fā)芽法,每個(gè)發(fā)芽盒放置2 層濾紙,加入25 mL 相應(yīng)濃度處理溶液,均勻擺放紅三葉種子,于人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)過程中不再加入處理液。

    苗期脅迫試驗(yàn)在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行,試驗(yàn)期 60 d(2021 年 1 月 5 日-3 月 6 日),氣候室溫度為(24±2)℃,濕度50%~60%。試驗(yàn)處理設(shè)置3 個(gè)Cu2+脅迫濃度:5、20 和50 mmol·L-1,對(duì)照為去離子水,每個(gè)處理4 次重復(fù),每個(gè)重復(fù)8 株苗。采用盆栽法,花盆上部?jī)?nèi)徑15 cm,底部?jī)?nèi)徑13 cm,高15 cm,底部有孔;每個(gè)花盆裝等量“品氏”泥炭土(PINDSTRUP SPHAGNUM),使土壤表面低于花盆約2 cm;每盆播種12~15 粒,出苗后定苗8 株,期間正常澆水;待幼苗正常生長(zhǎng)至3 片真葉出現(xiàn),停止?jié)菜? d 后進(jìn)行脅迫處理。方法是將所有試驗(yàn)花盆放入多個(gè)方形塑料試驗(yàn)箱內(nèi)(60 cm×60 cm×15 cm),保證同一Cu2+脅迫濃度處理的種質(zhì)材料放置在相同的試驗(yàn)箱內(nèi);將配制完成的某一濃度Cu2+處理液澆灌至對(duì)應(yīng)的處理組花盆內(nèi),一次性澆透,然后向試驗(yàn)箱內(nèi)加入相應(yīng)濃度處理液至約5 cm 高,確保每個(gè)試驗(yàn)箱加入的Cu2+處理液量相等;對(duì)照組按相同方法加入等量去離子水。為防止溶液蒸發(fā),用塑料膜將試驗(yàn)箱與花盆之間的空隙封閉,試驗(yàn)期間不再添加處理液或去離子水,利用泥炭土的吸水特性可以保證土壤中的Cu2+濃度維持不變。

    1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

    在種子萌發(fā)第10 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)及測(cè)定胚根特征指標(biāo)。發(fā)芽率(germination ratio,GR):統(tǒng)計(jì)每個(gè)發(fā)芽盒內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù),以發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)的百分比表示發(fā)芽率;胚根長(zhǎng)度(radicle length,RL)和胚根直徑(radicle diameter,RD):利用掃描儀(Expression 10000XL,日本)掃描根系后,用根系分析系統(tǒng)(WinRHIZO software 5.0,Regent instruments,加拿大)進(jìn)行分析,每個(gè)重復(fù)測(cè)定10 株,取平均值。

    苗期脅迫各性狀指標(biāo)在脅迫14 d 后進(jìn)行。存活率(survival ratio,SR):統(tǒng)計(jì)每個(gè)花盆紅三葉存活株數(shù),以植株未枯死并有正常綠色生長(zhǎng)芽為存活株,以脅迫后存活株數(shù)占處理前定苗株數(shù)的百分比表示存活率;地上生物量(aboveground biomass,AB):收獲每株幼苗地上部分莖葉(已死亡植株收集其干枯莖葉),置于烘箱105 ℃殺青1 h,然后75 ℃烘干至恒重后稱重;地下生物量(underground biomass,UB):收獲每株幼苗地下部分根系,洗凈后擦干水,置于烘箱105 ℃殺青1 h,然后75 ℃烘至恒重后稱重;根冠比(root to stem ratio,RSR)以地下生物量與地上生物量的比值表示;利用根系分析系統(tǒng)測(cè)定根總長(zhǎng)度(total root length,TRL)、根尖數(shù)(number of root tip,NRT)和根體積(root volume,RV),每個(gè)重復(fù)測(cè)定6 株。

    1.4 耐銅性綜合評(píng)價(jià)

    采用隸屬函數(shù)法[31-32]進(jìn)行紅三葉耐銅性綜合評(píng)價(jià);參照張鶴山等[33]的方法計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。

    1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)值確立 假定一個(gè)耐銅性理想品種的參考數(shù)列,記為{X0(k)}(k=1,2,3,…,n),n為用于評(píng)價(jià)的性狀指標(biāo)數(shù)。被評(píng)價(jià)種質(zhì)的比較數(shù)列記為{Xi(k)}(i=1,2,3,…,m),m為紅三葉種質(zhì)數(shù)。關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式為:

    式中:Ai(k)為第i個(gè)材料第k個(gè)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)值;|X0(k)-Xi(k)|表示X0(k)數(shù)列與Xi(k)數(shù)列在k點(diǎn)的絕對(duì)差值;minimink|X0(k)-Xi(k)|為二級(jí)最小差值;maximaxk|X0(k)-Xi(k)|為二級(jí)最大差值;ρ為分辨系數(shù),本研究取值0.5。

    1.4.2 各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

    式中:ωk表示第k個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù);Pk為第k個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)。

    1.4.3 各種質(zhì)關(guān)聯(lián)系數(shù)

    式中:ri為第i個(gè)種質(zhì)材料的關(guān)聯(lián)系數(shù),其值越大表示該種質(zhì)越接近理想品種,其耐銅性越強(qiáng)。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    以相對(duì)值為基礎(chǔ)分析數(shù)據(jù),即脅迫處理下的測(cè)定值與對(duì)照處理下的測(cè)定值的比值。采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan 法多重比較,采用分層聚類法聚類分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 萌發(fā)期Cu2+脅迫下各性狀特征及差異分析

    Cu2+脅迫對(duì)紅三葉種質(zhì)發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度和胚根直徑具有顯著影響(表2)。隨著Cu2+濃度的增加,發(fā)芽率逐漸下降,Cu2+脅迫濃度在0.5~4.0 mmol·L-1時(shí),紅三葉發(fā)芽率為對(duì)照的94%,但濃度增至8.0 mmol·L-1時(shí),發(fā)芽率下降至對(duì)照的78%。胚根長(zhǎng)度和胚根直徑受Cu2+脅迫影響較為明顯,在8.0 mmol·L-1的Cu2+脅迫下,紅三葉胚根無法正常生長(zhǎng)。在0.5 mmol·L-1時(shí),胚根長(zhǎng)度為對(duì)照的54%,在4.0 mmol·L-1時(shí)僅為對(duì)照的13%;胚根直徑在Cu2+脅迫下增大,即使Cu2+濃度在0.5 mmol·L-1時(shí)胚根直徑也為對(duì)照的110%,在Cu2+濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)更是達(dá)到156%。

    表2 紅三葉萌發(fā)期發(fā)芽率及根系特征Table 2 Germination rate and root characteristics of red clover in the germination stage

    不同種質(zhì)間性狀差異最大的為4.0 mmol·L-1處理下的胚根長(zhǎng)度,其最大值(0.47)為最小值(0.06)的7.83倍,差異最小的為2.0 mmol·L-1處理下的發(fā)芽率(1.28 倍)。相同性狀在不同處理下其指標(biāo)值亦有差異,發(fā)芽率在8.0 mmol·L-1濃度脅迫下比其他3 個(gè)處理有更大的變異幅度,其最大值為最小值的1.52 倍,而在0.5、2.0 和4.0 mmol·L-1處理下分別為 1.30、1.28 和1.35 倍;胚根長(zhǎng)度變化幅度隨濃度的增加而增大,在 0.5、2.0 和4.0 mmol·L-1處理下其最大值分別為最小值的1.73、3.30 和7.83 倍;而胚根直徑在2.0 mmol·L-1處理時(shí)其指標(biāo)最大值為最小值的1.86 倍。變異系數(shù)結(jié)果表明,4.0 mmol·L-1處理下的胚根長(zhǎng)度變異程度最大(70.14%),其次為2.0 mmol·L-1處理下胚根長(zhǎng)度(30.78%),而2.0 mmol·L-1處理下發(fā)芽率變異程度最?。?.45%),這與各性狀特征差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。經(jīng)方差分析,紅三葉種質(zhì)在發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)度的所有處理梯度均具有顯著差異性(P<0.05),其中發(fā)芽率在 0.5、2.0 和 4.0 mmol·L-1處理下、胚根長(zhǎng)度在 2.0 和 4.0 mmol·L-1處理下種質(zhì)間在 0.001水平差異顯著(P<0.001);胚根直徑僅在0.5 mmol·L-1的Cu2+脅迫下種質(zhì)間存在顯著差異(P<0.05)。

    2.2 苗期Cu2+脅迫下各性狀特征及差異分析

    相比于萌發(fā)期,紅三葉幼苗具有更高的Cu2+耐受性(表3)。在5 mmol·L-1脅迫時(shí),紅三葉所有種質(zhì)均可存活并正常生長(zhǎng),在20 mmol·L-1時(shí)平均存活率達(dá)到87%;但是Cu2+脅迫濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí),種質(zhì)平均存活率快速下降,僅為3%。Cu2+脅迫顯著抑制了紅三葉莖葉和根系的生長(zhǎng),Cu2+脅迫處理下的紅三葉地上生物量和地下生物量均低于對(duì)照,在脅迫濃度為5 mmol·L-1時(shí)分別為對(duì)照的69%和57%,在50 mmol·L-1時(shí)則僅為對(duì)照的31%和10%。從根冠比看,所有處理的根冠比相對(duì)值均小于1,說明Cu2+脅迫對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)于地上莖葉部分。表征根系特征的指標(biāo)如根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根體積在不同Cu2+脅迫濃度下具有一致的變化趨勢(shì),均隨脅迫濃度的增加而減小,在5 mmol·L-1時(shí),根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根體積分別為對(duì)照的76%、60%和68%,在50 mmol·L-1時(shí)分別降低到對(duì)照的19%、11%和28%,這與地下生物量性狀變化趨勢(shì)相一致。變異分析表明,紅三葉苗期變異系數(shù)最大的性狀是50 mmol·L-1Cu2+脅迫下的存活率,為175.71%,其次為50 mmol·L-1Cu2+脅迫下根冠比,變異系數(shù)為109.40%。在不同Cu2+濃度處理下,各性狀變異系數(shù)均隨脅迫濃度的增加而增大,說明Cu2+脅迫濃度的增加進(jìn)一步突顯了種質(zhì)間的差異。進(jìn)一步方差分析表明,不同處理濃度下,各性狀在紅三葉種質(zhì)間的差異性有所不同。在5 mmol·L-1處理下,不同紅三葉種質(zhì)材料間只有根尖數(shù)存在顯著差異(P<0.01);而在20 mmol·L-1處理時(shí),所有性狀均存在顯著差異(P<0.05)。在50 mmol·L-1處理下,除存活率性狀外,種質(zhì)間其他性狀均差異顯著??梢姡啾扔诘虲u2+脅迫濃度(5 mmol·L-1),20 或50 mmol·L-1的Cu2+脅迫濃度可以更好地區(qū)分紅三葉不同種質(zhì)間耐銅性的差異。

    表3 苗期各指標(biāo)特征差異性Table 3 The difference between characteristics of red clover in the seedling stage

    2.3 苗期各性狀差異性分析

    為進(jìn)一步理解Cu2+脅迫濃度和種質(zhì)雙重因素對(duì)紅三葉各性狀的影響,對(duì)10 個(gè)性狀進(jìn)行了雙因素方差分析(表4)。分析表明,所有性狀在不同Cu2+脅迫濃度間和不同種質(zhì)間均達(dá)到差異顯著水平(P<0.05),其中,除根冠比和存活率外,其余性狀更是在P<0.001 水平上呈顯著差異,說明這些性狀可以作為紅三葉種質(zhì)耐銅性篩選評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)。綜上分析,0.5 mmol·L-1Cu2+處理下的3 個(gè)萌發(fā)性狀(發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度和胚根直徑)和20 mmol·L-1Cu2+處理下的7 個(gè)苗期性狀(存活率、地上生物量、地下生物量、根冠比、根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)、根體積)在不同紅三葉種質(zhì)間均具有顯著的差異性,因此,本研究將這些指標(biāo)用于后續(xù)的灰色關(guān)聯(lián)分析、相關(guān)性分析和回歸分析。

    表4 10 個(gè)耐銅性指標(biāo)方差分析Table 4 Analysis of variance of 10 copper resistance indexes

    2.4 不同性狀相關(guān)性分析

    對(duì)所有材料的不同耐銅性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表5),胚根長(zhǎng)度與胚根直徑具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01),胚根長(zhǎng)度越小、直徑越大;地下生物量與地上生物量、根冠比、根尖數(shù)間具有顯著相關(guān)關(guān)系,且與根冠比、根尖數(shù)在0.001 水平顯著相關(guān);此外,根尖數(shù)與胚根長(zhǎng)度、根總長(zhǎng)度亦呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性,其中與根總長(zhǎng)度在0.001 水平上顯著相關(guān)。其余性狀間未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

    表5 10 個(gè)耐銅性狀相關(guān)性分析Table 5 Analysis of correlation of 10 copper resistance indexes

    2.5 紅三葉耐銅性綜合評(píng)價(jià)

    利用上述選取的10 個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析,首先利用公式(1)確定各材料每個(gè)性狀的標(biāo)準(zhǔn)值,然后利用公式(2)確定發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度、胚根直徑、存活率、地上生物量、地下生物量、根冠比、根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根體積的權(quán)重系數(shù),分別為0.029、0.060、0.064、0.040、0.109、0.152、0.158、0.107、0.154 和 0.127,再通過公式(3)計(jì)算紅三葉不同種質(zhì)與理想品種關(guān)聯(lián)系數(shù)(綜合評(píng)價(jià)值)(表6)。種質(zhì)CF022167 與理想材料的關(guān)聯(lián)度最高,綜合評(píng)價(jià)值為0.698,表示其對(duì)Cu2+脅迫的耐受性最強(qiáng);其次為種質(zhì)CF022178 和CF022232,綜合評(píng)價(jià)值分別為0.643 和0.636;關(guān)聯(lián)度最低的是種質(zhì)CF022234,綜合評(píng)價(jià)值僅為0.390。

    表6 紅三葉耐銅性綜合評(píng)價(jià)值及預(yù)測(cè)值Table 6 Comprehensive evaluation and prediction value based on 4 important traits of copper tolerance in red clover

    為篩選紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo),依據(jù)最小二乘法,通過回歸分析選擇對(duì)紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)具有顯著性的因子,得到最優(yōu)回歸模型。以上述耐銅性綜合評(píng)價(jià)關(guān)聯(lián)系數(shù)為因變量,以各指標(biāo)相對(duì)值為自變量,采用多元逐步回歸分析建立最優(yōu)回歸方程,得出各種質(zhì)耐銅性預(yù)測(cè)值(D值)與指標(biāo)的關(guān)系:D=0.1573X1+0.147X2+0.158X3+0.108X4,R2=0.977(P<0.01),式中:X1為胚根長(zhǎng)度;X2為幼苗存活率;X3為地下生物量;X4為根總長(zhǎng)度。分析發(fā)現(xiàn),利用該回歸模型預(yù)測(cè)的紅三葉耐銅性強(qiáng)弱與綜合評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致(表6),其預(yù)測(cè)值排序位次和綜合評(píng)價(jià)值相同的有16 個(gè)種質(zhì),占種質(zhì)材料總數(shù)量的1/2 以上,12 個(gè)種質(zhì)僅向前或后波動(dòng)一個(gè)位次,位次波動(dòng)最大的是種質(zhì)CF022230 和CF022172,其預(yù)測(cè)值比綜合評(píng)價(jià)值上升兩個(gè)位次??梢?,以4 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)建立的預(yù)測(cè)模型可以有效地對(duì)紅三葉種質(zhì)耐銅性強(qiáng)弱進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

    3 討論

    重金屬對(duì)植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育的影響一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[34]。許多研究表明,過量的Cu2+能夠氧化損傷植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)[35-36],降低種子萌發(fā)率,抑制植物根系生長(zhǎng)[37-38],這已在牧草植物如紅三葉[39]、紫花苜蓿[40]、多花黑麥草(Lolium multiflorum)[41]、蘇丹草[25]以及作物類如水稻(Oryza sativa)[42]、小麥(Triticum aestivum)[43]、番茄(Solanum lycopersicum)[44]等物種內(nèi)得到證實(shí)。魚小軍等[39]對(duì)銅脅迫下的紅三葉發(fā)芽率的研究表明Cu2+濃度為 200 mg·L-1(3.12 mmol·L-1)時(shí)相對(duì)發(fā)芽率為 82%,趙思怡等[45]發(fā)現(xiàn) Cu2+濃度為 100 mg·L-1時(shí) 51 份紅三葉種質(zhì)的平均相對(duì)發(fā)芽率為62%,本研究中30 份紅三葉平均相對(duì)發(fā)芽率在4.0 mmol·L-1時(shí)仍達(dá)到94%,可能是由種質(zhì)數(shù)量及種質(zhì)材料的差異引起的。胚根長(zhǎng)度隨著Cu2+脅迫濃度的增加而降低,在8.0 mmol·L-1時(shí)胚根生長(zhǎng)停滯,可能是由于植物中的銅離子毒性導(dǎo)致細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制[46-47]。相對(duì)于發(fā)芽率,紅三葉胚根對(duì)Cu2+脅迫更為敏感,王波等[48]在南荻(Triarrhena lutarioriparia)種子萌發(fā)中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,這可能是由于種子萌發(fā)時(shí)根尖最先突破種皮吸水,從而使根尖受脅迫時(shí)間較長(zhǎng),積累更多的重金屬[49]。因此,眾多研究者通常將根系變化作為非生物脅迫評(píng)價(jià)的主要依據(jù)。

    重金屬主要積累在草本植物的根部,以降低其對(duì)植物地上部分的損傷程度[50-52]。韓曉姝等[30]發(fā)現(xiàn)紅三葉根部對(duì)銅的積累高于莖葉部分,根系受危害程度更明顯,銅脅迫更多的是降低紅三葉的地下生物量,而對(duì)株高和地上生物量并沒有顯著影響。本研究結(jié)果與其不盡相同,本研究中所有銅脅迫處理不僅顯著降低了紅三葉的地下生物量、根總長(zhǎng)度、根體積和根尖數(shù),也抑制了紅三葉地上部分的生長(zhǎng),而且在高濃度(50 mmol·L-1)銅脅迫下,植株幾乎全部死亡。造成兩者結(jié)果不同的原因可能是前者是在紅三葉植株成株后(生長(zhǎng)季結(jié)束后)測(cè)定的數(shù)據(jù),由于植物本身對(duì)脅迫有防御和修復(fù)能力[53-54],使得不同脅迫強(qiáng)度間的差異弱化;而本研究指標(biāo)測(cè)定是在幼苗期(脅迫后第14 天),其對(duì)外界脅迫的反應(yīng)較為敏感,更能反映紅三葉種質(zhì)間的性狀差異。

    種子萌發(fā)期對(duì)外界脅迫較為敏感,而苗期能更好地模擬植物自然生長(zhǎng)條件,因此許多學(xué)者分別在種子萌發(fā)期[6,39,44,55]和幼苗生長(zhǎng)階段[30,56-57]研究銅脅迫對(duì)植物的影響。然而,植物抗逆性評(píng)價(jià)是一個(gè)綜合的多指標(biāo)分析過程,更全面的指標(biāo)可以使評(píng)價(jià)結(jié)果更客觀[32,58-59]。本研究采用隸屬函數(shù)法,以紅三葉萌發(fā)期和苗期的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行耐銅性綜合評(píng)價(jià),所有參與評(píng)價(jià)的性狀在紅三葉不同種質(zhì)間均具有顯著差異性,能夠有效區(qū)分種質(zhì)材料間耐銅性的強(qiáng)弱。對(duì)各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分析表明,苗期指標(biāo)具有更大的權(quán)重,其中地下生物量權(quán)重最大,幼苗期的根部特征指標(biāo)權(quán)重占比約70%,說明幼苗根系特征是紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)的主要指示性狀。綜合評(píng)價(jià)分析表明,種質(zhì)CF022167、CF022178 和CF022232 具有較強(qiáng)的耐銅能力,這與趙思怡等[45]研究結(jié)果有所差異,雖然其也發(fā)現(xiàn)種質(zhì)CF022167 具有較強(qiáng)的耐銅性,但卻將種質(zhì)CF022232 耐銅性評(píng)價(jià)為弱,一方面可能是本研究評(píng)價(jià)指標(biāo)除了萌發(fā)期的3 個(gè)指標(biāo)之外,還選擇了幼苗期的7 個(gè)指標(biāo),而后者只采用萌發(fā)期的性狀;另一方面,兩者選的試驗(yàn)樣本種類和數(shù)量不盡相同,抗性評(píng)價(jià)本就是一個(gè)相對(duì)的綜合比較,因此試驗(yàn)材料的差異也會(huì)造成結(jié)果的不同。

    紅三葉各性狀間具有不同程度的相關(guān)性[60],選擇更多的指標(biāo)參與評(píng)價(jià)使得結(jié)果更準(zhǔn)確,但也會(huì)增加研究難度,造成資源浪費(fèi)。因此,篩選在抗逆性評(píng)價(jià)中起關(guān)鍵作用的指示性指標(biāo)成為一種有效手段[61]。本研究從10 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)中篩選出胚根長(zhǎng)度、幼苗存活率、地下生物量和根總長(zhǎng)度4 個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo),建立其耐銅性預(yù)測(cè)值與綜合評(píng)價(jià)值回歸方程,依次對(duì)紅三葉種質(zhì)耐銅性進(jìn)行初步篩選。王瑞等[61]利用篩選出的5 個(gè)耐鹽關(guān)鍵指標(biāo)對(duì)42 份偃麥草(Elytrigia repens)進(jìn)行了評(píng)價(jià),其預(yù)測(cè)值與綜合評(píng)價(jià)值相關(guān)系數(shù)為0.979,本研究中相關(guān)系數(shù)為0.977,達(dá)顯著相關(guān)水平(P<0.01)。由此可見,以這4 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)構(gòu)建的回歸模型可以有效地對(duì)紅三葉耐銅性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

    4 結(jié)論

    無論在萌發(fā)期還是幼苗生長(zhǎng)階段,Cu2+脅迫對(duì)紅三葉生長(zhǎng)發(fā)育均有顯著的抑制作用,胚根長(zhǎng)度隨Cu2+濃度的增加而減小,但胚根直徑變大;相對(duì)于發(fā)芽率,胚根生長(zhǎng)對(duì)Cu2+脅迫更為敏感。在銅脅迫下,紅三葉幼苗地上生物量和地下生物量顯著降低,根尖數(shù)和根總長(zhǎng)度減少。紅三葉萌發(fā)期和苗期各性狀在不同Cu2+濃度間具有顯著差異性,并且同一性狀在不同紅三葉種質(zhì)間也具有顯著差異性。

    根系相關(guān)性狀如生物量、根尖數(shù)、根總長(zhǎng)度是紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)的重要權(quán)重指標(biāo),胚根長(zhǎng)度、幼苗存活率、地下生物量和根總長(zhǎng)度4 個(gè)指標(biāo)可以作為紅三葉耐銅強(qiáng)弱預(yù)測(cè)的關(guān)鍵指標(biāo)。紅三葉種質(zhì)CF022167、CF022178 及CF022232 具有較高的銅耐受性,可以作為紅三葉育種基礎(chǔ)材料或在生產(chǎn)中直接利用。

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