HPLC法測定蒙成藥薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A的含量

李玉華 姜 楠 李景清 安文源

內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市食品藥品檢驗(yàn)所,內(nèi)蒙 通遼 028000

薩仁-嘎日迪由紅花、黑云香、草烏、訶子、丁香、水銀(制)、石菖蒲、木香、硫黃、白硇砂、苘麻子、白云香(楓香脂)、草決明、蘇格木勒、草果仁、海金沙、方海、石膏、肉豆蔻、人工麝香、人工牛黃等二十一味藥組成。具有消“粘”腫，燥“協(xié)日烏素”，祛“亞瑪”等功效，用于治療半身不遂，左癱右瘓，風(fēng)濕骨痛，白喉，瘡瘍膿腫，鼻炎，偏頭痛等癥[1-2]。方中主藥紅花，性溫，味辛，具有散瘀止痛、活血通經(jīng)、抗腫瘤、抗菌、抗疲勞等多種生理活性[3-5]。作為臨床常用的蒙藥醫(yī)院制劑，薩仁-嘎日迪療效確切，未見任何不良反應(yīng)發(fā)生。但目前為止，該成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還停留在1984年版《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》階段，只有簡單的外觀性狀和檢查項(xiàng)目[6]。以紅花中主要活性成份羥基紅花黃色素A為指標(biāo)，建立薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A含量測定的方法，能有效控制該成藥的內(nèi)在質(zhì)量，為該成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(四元梯度泵，二級(jí)管陣列檢測器，Empower色譜工作站)，Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀(紫外檢測器，LabSolution工作站)，92SM-202A型電子天平，XS3DU電子天平，KQ5200DE超聲波清洗機(jī)。

1.2 試藥 對照品羥基紅花黃色素A(批號(hào)：110637-201810，含量93.1%)由中國食品藥品檢定研究院提供；水為高純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。4批薩仁-嘎日迪醫(yī)院制劑來源見表1。

表1 薩仁-嘎日迪成藥來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7-9]InertSustain AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為用三乙胺調(diào)至pH*6.0±0.1)的甲醇-乙腈-0.7%磷酸(19.5∶1.5∶79)，流速為1.0 mL/min，檢測波長403 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。記錄時(shí)間20 min，理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算，應(yīng)不低于4000。

2.2 對照品、供試品溶液及陰性對照品的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品7.514 mg，置50 mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1503 mg/mL的羥基紅花黃色素A對照品貯備液。精密吸取該對照品貯備液2 mL，置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，即得羥基紅花黃色素A(30.06 μg/mL)對照品溶液。

取樣品粉末(過四號(hào)篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過后作為供試品溶液。

取處方中除紅花以外的二十味藥材，粉碎成細(xì)粉，按處方比例稱重，其中人工麝香、人工牛黃需與其它藥材細(xì)粉配研，所有藥材粉末混合均勻，過篩，涼開水泛丸，銀朱包衣，打光，干燥，即得陰性對照品。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取按處方比例制備的不含紅花藥材的陰性對照品，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備法制得陰性對照品溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照品色譜圖中在與羥基紅花黃色素A對照品以及供試品色譜圖相對應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性強(qiáng)，其他組分對羥基紅花黃色素A的測定無干擾。色譜圖如圖1所示。

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照1. 羥基紅花黃色素A 圖1 對照品、供試品及陰性對照品圖譜

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下羥基紅花黃色素A對照品貯備液(0.1503mg/mL)200、1000、2000、4000、6000、8000 μL，置于10 mL量瓶中，用25%甲醇稀釋定容后得到3.006、15.03、30.06、60.12、90.18、120.24 μg/mL系列濃度的對照品溶液。精密吸取上述各梯度濃度的對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對照品的量X為橫坐標(biāo)，得到羥基紅花黃色素A回歸方程為：Y=34186X，r=0.9999。表明羥基紅花黃色素A在0.03006～1.2024 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，精密稱取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品2.0115 g，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備法配制成精密度試驗(yàn)溶液，精密吸取該溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積的RSD值為0.64%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品2.0053 g，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，精密吸取該溶液10 μL，分別于0、2、4、6、12、24 h注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)峰面積的RSD值為0.93%，表明該方法提取的樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品6 份，每份約2.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果6份平行樣含量平均值為0.3711 mg/g，RSD為1.15%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已測得含量的樣品(扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128，含量為0.3711 mg/g)9份，每份約1.0g，每三份一組，精密稱定，置具塞錐形瓶中，再精密加入羥基紅花黃色素A對照品貯備液(0.1503 mg/mL)1250、2500、3750 μL，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，配制成高、中、低3個(gè)濃度的加標(biāo)回收溶液，精密量取各加標(biāo)回收溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。3個(gè)濃度加標(biāo)回收率平均值為97.38%，RSD值為0.88%。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.9 色譜柱、儀器設(shè)備的耐用性試驗(yàn) 換不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱及不同的液相色譜儀，取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取該樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A含量。結(jié)果見表3。從表中數(shù)據(jù)可以看出，羥基紅花黃色素A含量變化不大(RSD為1.05 %)，表明該方法對不同色譜柱和儀器設(shè)備耐用性良好。

表3 不同色譜柱、不同儀器的耐用性試驗(yàn)

2.10 樣品含量測定[10]分取4個(gè)廠家提供的薩仁-嘎日迪樣品粉末約2.0g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取各樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，測定結(jié)果見表4。

表4 4批薩仁-嘎日迪樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果 (n=3)

續(xù)表4 表4 4批薩仁-嘎日迪樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果 (n=3)

從表4數(shù)據(jù)可以看出：不同醫(yī)院制劑室提供的4批成藥中，羥基紅花黃色素 A 的含量存在著明顯的差異?？紤]到所用的紅花藥材之間的含量差異，同時(shí)對各批成藥相對應(yīng)的紅花原藥材的含量進(jìn)行了測定，計(jì)算出各批成藥中羥基紅花黃色素A的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表5。

表5 4批薩仁-嘎日迪樣品羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率 (n=3)

表5中數(shù)據(jù)顯示，不同制劑室生產(chǎn)的4批成藥中，薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A的平均轉(zhuǎn)移率在75.5%～100.0%之間。參考《中國藥典》2015 年版一部“紅花”含量測定項(xiàng)下規(guī)定含羥基紅花黃色素 A 量不得少于 1.0%[8]，結(jié)合各批成藥的平均轉(zhuǎn)移率，暫定本品每1 g含紅花以羥基紅花黃色素A(C27H32O16)計(jì)，不得少于0.33 mg。

3 討論

參照《中國藥典》2015[6]年版一部“紅花”含量測定項(xiàng)下羥基紅花黃色素A的測定方法[8]，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸(26∶2∶72)為流動(dòng)相，結(jié)果目標(biāo)峰羥基紅花黃色素A拖尾因子1.49，拖尾嚴(yán)重，調(diào)整流動(dòng)相比例甲醇-乙腈-0.7%磷酸(19.5∶1.5∶79)，并用三乙胺調(diào)至pH(6.0±0.1)，此時(shí)目標(biāo)峰羥基紅花黃色素A拖尾因子1.102，與其它干擾組分分離較好，保留時(shí)間適宜，理論塔板數(shù)較高。故作為檢測流動(dòng)相。

成藥粉末以25%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取(功率120 W，頻率40 kHz)，為保證被測成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取40、50、60 min不同超聲提取時(shí)間對提取效率的影響，結(jié)果羥基紅花黃色素A的含量基本一致(RSD 0.51%)，故提取時(shí)間定為40 min。

通過專屬性，精密度，穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)，色譜柱及不同儀器設(shè)備的耐用性考察，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，可作為薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A含量測定的方法。