草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因序列分析

劉倩琪 王學林

（廣東省深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心，廣東 深圳 518000）

bar基因來源于土壤吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus），具有良好的抗草丁膦除草劑的性能，多用作轉(zhuǎn)基因植物的選擇標記。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織（ISAAA）公布，油菜、棉花、菊苣、玉米、水稻、大豆等6種植物58個品系以bar作為篩選標記基因。

我國在轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)、選育、鑒定過程中，常把bar基因作為轉(zhuǎn)基因成分檢測的重要靶標元件。

研發(fā)機構(gòu)因研究材料差異而選擇不同的bar基因或者改造bar基因作為分子標記，國標、行標中bar基因則規(guī)定檢測175 bp和262 bp兩個片段，顯然無法滿足bar基因多樣性的要求；檢測出與目的片段大小不一致的特異性電泳條帶，按照標準判定為陰性，可能會造成漏檢；普通的凝膠電泳分辨率較低，亦無法判斷待測樣外源基因序列是否與標準提供的序列一致，從而導致目的片段差異較小或序列內(nèi)部存在差異時，難以判定。

本文針對檢測工作中發(fā)現(xiàn)的水稻和小麥兩個待測樣中與目標序列不同的特異性bar基因片段，采用PCR產(chǎn)物測序法進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)水稻和小麥待測樣品的bar基因盡管上下游引物序列相同，內(nèi)部基因序列差異較大，相似度低，說明測序技術能夠更精準地判定待測樣陰陽性，該研究轉(zhuǎn)基因成分檢測及其標準修訂具有重要的參考意義。

1.材料與方法

1.1 材料

水稻種子由上級主管部門的市場監(jiān)督抽查任務所獲得，小麥樣品為某品牌在售干面條；標準對照樣品為檢測bar基因的MS1。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

取100 g水稻樣品種子于粉碎機粉碎后取研磨杯杯壁細粉100 mg分裝至離心管備用；小麥樣品取100g樣品折碎后于粉碎機粉碎，同樣取研磨杯杯壁細粉100 mg分裝至離心管備用；標準樣品直接取樣100 mg分裝至離心管，采用DNeasy Plant Mini Kit試劑盒，按照其操作手冊，提取樣品DNA，經(jīng)超微量核酸蛋白分析儀測定DNA濃度及純度，后調(diào)整濃度至50 ng/μl，-20℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及序列

根據(jù)現(xiàn)行《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測bar或pat基因定性PCR方法》（農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號公告）公布的bar基因引物序列（bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3’，bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'），分別合成bar基因的上下游引物。bar基因標準序列如下：

1.2.3 PCR擴增及PCR產(chǎn)物檢測

DNA模板2μl、5μl Taq聚合酶、上下游引物各0.2μl，加水2.6μl定容至10μl反應體系。PCR反應程序：94℃10s；94℃ 5s，60℃ 34s，35 cycles；10℃ ∞。PCR 產(chǎn)物用2% 濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 序列分析

待測樣和對照樣bar基因的PCR擴增產(chǎn)物由華大基因公司進行雙向測序，重復2次，測定的上下游序列采用MEGA3.1 軟件進行分析和拼接。

2.結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖電泳凝膠結(jié)果分析

根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測bar或pat基因定性PCR方法》（農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號公告）公布的bar基因目的片段大小為262 bp，經(jīng)凝膠電泳檢測（見圖2）。與參照樣品的PCR產(chǎn)物片段大小相比，待測樣1的目標條帶偏小，約為240 bp；待測樣2的目標條帶偏大，約為500 bp。由于凝膠電泳檢測法分辨率較低，只能檢測出bp值區(qū)間段而不能準確識別具體bp值，為了確定準確bp值，對PCR產(chǎn)物進行目標序列測序。

注：M為DL-2000Marker,1為待測樣品1，2為待測樣品2，CK+為陽性參照，CK-為空白對照

2.2 目標序列測序結(jié)果

利用MEGA 3.1軟件對上下游測序結(jié)果進行分析。下游序列反轉(zhuǎn)后，與上游序列比對，剔除序列兩端不可靠堿基位點，搜尋出上下游引物位置及中間重疊區(qū)域，將序列拼接完整。測序結(jié)果顯示目標序列的個別位點存在套峰現(xiàn)象（見圖2），待測樣1在bar基因上游序列的第113個堿基存在G堿基中嵌套A堿基，下游序列反轉(zhuǎn)后確定該處堿基為G；待測樣2在多個位點存在套峰，不影響峰圖判定。

2.3 序列拼接結(jié)果

經(jīng)MEGA3.1 軟件分析，上游序列末端比對出下游引物序列bar-R: bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'（見圖3），下游序列反轉(zhuǎn)后，在起始端比對出上游引物序列bar-F:5’-GAAGGCACGCAACGCC-3’，上下游序列拼接結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測樣1的bar基因序列為236 bp（見圖3 ），比檢測標準中的提供的標準序列小26 bp；待測樣2的bar基因序列為486 bp（見圖4），比標準中的序列片段大224 bp。

圖3 bar基因PCR產(chǎn)物上下游序列（圖示部分序列）

圖4 水稻待測樣1 bar序列拼接結(jié)果（陰影示上下游引物位置）

2.4 序列比對分析

經(jīng)過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，待測樣1和2的bar基因序列與標準提供的序列盡管上下游引物序列相同，但內(nèi)部序列與標準序列均不同（見圖5）。待測樣1的bar基因序列在第37、42～45、102、110～ 113、131～ 132、159～169、216、228～231等26個位點發(fā)生堿基缺失，內(nèi)部序列存在103個堿基不同，僅133個堿基相同，序列相似度僅為50.76%。

圖5 小麥待測樣2 bar序列拼接結(jié)果（陰影示上下游引物位置）

農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號公告提供的262 bp的bar基因序列與美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫的序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列在已知的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系、克隆載體pbar-35S和pSAT1A-ocsAocsP-bar-ocsT均存在100%的同源序列。待測樣1的bar序列有129個堿基與土壤中的鞘氨醇胞菌BN140058亞種存在73%相似度，但上下游引物均不匹配。待測樣2的bar序列有254個堿基與野生二粒小麥在LOC119283572存在71%非典型相似度，且上下游引物均不匹配（見圖7）。測序結(jié)果表明待測樣1和2可能分別來源于鞘氨醇胞菌和野生小麥，盡管PCR擴增出特異性片段，片段大小與目的序列不一致，測序結(jié)果與標準序列差異較大，與現(xiàn)有已知序列相似度低，故不能判定2個待測樣的bar基因為轉(zhuǎn)基因陽性。

圖6 水稻待測樣1與bar基因標準序列比對結(jié)果（★示堿基位點相同）

圖7 小麥待測樣2 bar 序列與NCBI網(wǎng)站序列比對結(jié)果

3.結(jié)論與討論

農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號公告提供的序列為262 bp，國標GB/T 19495.4-2018提供的bar基因片段大小為175 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫中存在多個同源序列。待測樣水稻中的 bar基因序列比已知序列小26 bp，可能來源于土壤中的鞘氨醇胞菌；待測樣小麥中的 bar基因序列比已知序列大223 bp，可能來源于野生小麥；待測樣水稻中的 bar基因序列與已知序列同源性僅50.76%，待測樣小麥中的 bar基因序列與標準序列幾乎無同源性，該兩個樣品的bar基因檢測結(jié)果應判定為陰性。

標準選擇的175 bp和262 bp是bar基因的骨干序列，但bar基因的完整需要遠大于262 bp。我國2008年啟動轉(zhuǎn)基因重大專項以來，已經(jīng)十多年，國內(nèi)研究轉(zhuǎn)基因水稻、小麥、油菜等作物的科研機構(gòu)較多。bar基因是常用的植物轉(zhuǎn)基因的選擇標記，各研發(fā)單位采用的bar基因偏差段大小從100多bp到500 多bp都有，因此該基因序列極有可能是存在經(jīng)過基因改造的新的外源片段，在檢測工作中應予以重視，必要時應輔助其它外源基因或測序加以判定。在轉(zhuǎn)基因成分鑒定的標準修訂時，應針對與目標片段大小不一致的特異性電泳條帶，考慮采用測序、酶切等方法加以佐證，以防漏檢或誤檢。