細(xì)胞永生化技術(shù)研究進(jìn)展

劉育昆 鄒登朗 祁得勝 劉忠浩 都玉蓉 馬建濱

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧，810008)

細(xì)胞永生化是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。而永生化自發(fā)發(fā)生的概率極低，嚙齒類動物自發(fā)性永生化自發(fā)發(fā)生的概率為10-6—10-5，而人類細(xì)胞永生化自發(fā)發(fā)生的概率則小于10-12[1]。正常情況下在體外條件下培育的細(xì)胞可以產(chǎn)生有限次數(shù)的增殖以及傳代，但經(jīng)過有限次數(shù)增殖和傳代后，細(xì)胞就會停止增殖并發(fā)生衰老滅亡，這種情況限制了有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)進(jìn)行，研究者通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞中，使永生化基因在靶細(xì)胞基因組中整合并表達(dá)，建立永生化細(xì)胞系。目前研究顯示端粒的長度以及端粒酶的活性與細(xì)胞永生化的關(guān)聯(lián)較密切。研究者對細(xì)胞永生化發(fā)生機(jī)制的研究獲得了較大進(jìn)展，本文在細(xì)胞永生化基本原理的基礎(chǔ)上，對細(xì)胞永生化方法進(jìn)行概述。

1 細(xì)胞永生化原理

人的正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)并分裂一段時(shí)間后會進(jìn)入衰老期(M1期)。除干細(xì)胞、生殖細(xì)胞外，大部分真核生物細(xì)胞都具有該特性。例如人上皮細(xì)胞在分裂40至60代后就會停止生長，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，保證DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機(jī)制就會發(fā)送細(xì)胞周期停止信號，阻止DNA合成，細(xì)胞不再分裂并開始衰老，而病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等則可越過衰老期而進(jìn)入增長抑制狀態(tài)，即危機(jī)期(M2期)。細(xì)胞在該周期中會逐漸出現(xiàn)退化、死亡的現(xiàn)象；只有罕見的細(xì)胞在某些因素的作用下可以激活端粒酶。為了補(bǔ)充或延長端粒，維持端粒長度，這些細(xì)胞以自身RNA為模板合成端粒DNA，從而維持染色體的穩(wěn)定性，使細(xì)胞可以順利跳過M2期，從而獲得無限分裂增殖的能力，最終發(fā)生細(xì)胞永生化[2]。

2 促細(xì)胞永生化的幾種方法

2.1 篩選自發(fā)突變產(chǎn)生的永生化細(xì)胞

這種永生化細(xì)胞是在培養(yǎng)期間發(fā)生基因突變引起的，這些細(xì)胞逾越復(fù)制以及衰老的原理尚不清楚，且基因型不穩(wěn)定，較易丟失有關(guān)來源組織的細(xì)胞特性。該方法大部分應(yīng)用于嚙齒類動物細(xì)胞的永生化[3]。

2.2 化學(xué)致癌物以及射線因素產(chǎn)生細(xì)胞永生化

通過電離輻射、X射線、核輻射、60Co等照射處理細(xì)胞，使細(xì)胞通過射線照射誘導(dǎo)發(fā)生永生化。由于放射性元素破壞了細(xì)胞穩(wěn)定性，使染色體重組，抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)與細(xì)胞周期延長有關(guān)基因的表達(dá)，從而維持端粒長度，使細(xì)胞老化過程不能正常進(jìn)行，因此細(xì)胞將無限增殖[4]。1997年O’Reilly等[5]通過紫外燈照射2個(gè)人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)紫外燈照射能增加這2個(gè)細(xì)胞系的存活壽命。使用化學(xué)致癌物方法使細(xì)胞永生化的原理與射線因素產(chǎn)生細(xì)胞永生化的原理相同，但是這兩種方法都會使基因組產(chǎn)生部分隨機(jī)損傷，所以隨著技術(shù)的先進(jìn)化，這兩種方法已經(jīng)不再常見。

2.3 病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞永生化

將病毒通過轉(zhuǎn)化感染到正常細(xì)胞中，可以改變基因，使部分細(xì)胞成功渡過兩個(gè)致死期，得到無限增殖的能力，從而誘導(dǎo)細(xì)胞永生化[6]。病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞永生化是將整個(gè)病毒基因組導(dǎo)入細(xì)胞，這樣會改變細(xì)胞表型，應(yīng)用于病毒的特定宿主細(xì)胞且容易使細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。例如人乳頭狀瘤病毒、EB病毒、猴腎病毒SV40。

2.3.1 人乳頭狀瘤病毒(HPV)

人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus)是一種對上皮細(xì)胞具有高度特異性的DNA腫瘤病毒，該病毒會引起細(xì)胞增殖，將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成乳頭狀瘤細(xì)胞。人乳頭狀瘤病毒的永生化率可達(dá)10-5[7]。德國科學(xué)家Harald zur Hausen 獲得2008年諾貝爾生理學(xué)獎，證實(shí)了HPV病毒可誘導(dǎo)病發(fā)宮頸癌。在HPV編碼基因中，占基因組50%的早期區(qū)表達(dá)蛋白含有E1—E8 8個(gè)閱讀區(qū)，其中E6和E7兩個(gè)閱讀區(qū)編碼相應(yīng)蛋白，可以改變細(xì)胞的末期分化，使細(xì)胞逾越保證DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機(jī)制，從而使細(xì)胞永生化。所以E6和E7兩個(gè)閱讀區(qū)在細(xì)胞永生化中起到了關(guān)鍵作用。有實(shí)驗(yàn)表明被HPV感染的上皮細(xì)胞內(nèi)端粒的長度停止縮短并不斷增長，使細(xì)胞達(dá)到永生化[8]。

2.3.2 EB病毒

EBV是皰疹病毒(Epstein-Barr virus)，EBV在體外能和培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞融合，進(jìn)而感染B淋巴細(xì)胞，使基因通過顯性表達(dá)改變細(xì)胞周期[9]，使其正常細(xì)胞形成永生化的淋巴細(xì)胞系。研究發(fā)現(xiàn)EBV永生化B細(xì)胞的過程主要有6種病毒基因表達(dá)：EBV核抗原1(EBNA1)、核抗原2(EBNA2)、核抗原3A(EBNA3A)、核抗原3C(EBNA3C)、核抗原LP(EBNA-LP)以及潛伏膜蛋白1(LMP1)[10]。EBNA1在病毒的潛伏期和裂解周期都有表達(dá)，在病毒的復(fù)制和分離中起著重要作用，EBNA1是一種序列特異性DNA結(jié)合蛋白，能幫助病毒基因與細(xì)胞有絲分裂染色體結(jié)合[11-12]，Mühe等[13]發(fā)現(xiàn)EBNA2通過一個(gè)結(jié)構(gòu)域傳遞信號以啟動B細(xì)胞永生化，然后利用單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域維持永生化B細(xì)胞生長，并且EBNA2能與EBNA-LP相互作用，共同激活[14]。B細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化時(shí)，EBNA3A、EBNA3C、LMP-1起到了至關(guān)作用。EBV癌蛋白LMP-1組成型激活NF-κB，促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖并抑制凋亡，對EBV永生化B細(xì)胞的存活至關(guān)重要[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，被EB病毒感染的淋巴細(xì)胞內(nèi)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平有所上升，但是細(xì)胞壽命并未縮短，這個(gè)發(fā)現(xiàn)證明了EB病毒可以抑制抑癌基因活性，具有永生化淋巴細(xì)胞的能力[16]，EB病毒永生化的B淋巴細(xì)胞的最顯著特點(diǎn)是提高端粒酶活性，提高端粒酶活性可能是B淋巴細(xì)胞永生化的關(guān)鍵原因，當(dāng)前研究中應(yīng)用EB病毒感染細(xì)胞使細(xì)胞永生化最多的是B淋巴細(xì)胞，在其他細(xì)胞永生化中的應(yīng)用不多[17]。

2.3.3 猴腎病毒(SV40)

猿猴病毒SV40是由LT和st兩種抗原及相關(guān)蛋白組成的簡單的真核細(xì)胞病毒，由于猿猴病毒SV40對細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化、瘤化的高效性，現(xiàn)在已應(yīng)用于真核細(xì)胞生物工程實(shí)驗(yàn)[18]。1989年Shay等研究表明，通常情況下，猿猴病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)發(fā)生永生化的概率極低；SV40誘導(dǎo)細(xì)胞永生化涉及很多因素，其中LT片段起了決定性作用前對SV40轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生永生化的具體機(jī)制尚未明確[17]。1997年Srinivasan等[19]研究猜測將SV40的T抗原片段整合到靶細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，這可能是因?yàn)門抗原片段與pRB-E2F復(fù)合體結(jié)合，使E2F從pRB-LT復(fù)合體中分離出來，抑制細(xì)胞衰老，從而達(dá)到細(xì)胞永生化。2019年生立平等[20]證實(shí)SV40T能夠獨(dú)自使施旺細(xì)胞(SCs)啟動重編程，使SCs轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)干細(xì)胞。目前，研究者發(fā)現(xiàn)了很多將正常細(xì)胞通過SV40轉(zhuǎn)染成永生細(xì)胞株的方法，其中共培養(yǎng)野生型SV40病毒法感染靶細(xì)胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法等效果顯著[17]。

2.4 端粒-端粒酶激活誘導(dǎo)細(xì)胞永生化

端粒具有獨(dú)特的帽狀結(jié)構(gòu)，它們存在于真核細(xì)胞染色體的頭端和尾端，由DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。端粒長度約為5—15 kb，擔(dān)負(fù)重要的生理功能，包括維持染色體結(jié)構(gòu)和位置的穩(wěn)定性，防止化學(xué)酶降解染色體，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常功能，決定細(xì)胞壽命等[21]。端粒長度與有絲分裂次數(shù)有關(guān)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞分裂1次，端粒就會縮短50—200 bp[22]。所以端粒被稱為細(xì)胞壽命的“有絲分裂鐘”。而端粒酶是一種催化端粒自我復(fù)制并負(fù)責(zé)端粒的延長的逆轉(zhuǎn)錄酶。它也是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要生物因子。它的功能是通過轉(zhuǎn)錄自身的RNA序列形成一個(gè)新的端粒DNA序列，用來補(bǔ)充缺少的端粒，保持端粒的長度和細(xì)胞的無限分裂[17]。端粒酶是細(xì)胞永生化的關(guān)鍵。一般情況下，大部分的體細(xì)胞端粒酶在表達(dá)時(shí)是嚴(yán)格調(diào)控的，同時(shí)表達(dá)是低水平和瞬時(shí)的[23]。但在細(xì)胞永生化之后，其端粒酶的活性會明顯增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT作為端粒酶的催化亞單位，與相關(guān)蛋白結(jié)合后可以激活端粒酶，延長體外細(xì)胞培養(yǎng)的生命周期[24]。它是端粒酶的正向調(diào)節(jié)因子[25-27]。利用端粒-端粒酶激活誘導(dǎo)細(xì)胞永生化是當(dāng)前細(xì)胞永生化最有效的方法，應(yīng)用最多的方法。但是該方法可以使大多數(shù)人類或動物細(xì)胞永生化，但是對于某些細(xì)胞來說，只憑借該方法不足以使細(xì)胞永生化，還需要其他方法輔助進(jìn)行。

2.5 可回復(fù)性永生化

可回復(fù)性永生化的基本原理是將篩選的永生化基因?qū)胫猎?xì)胞，從而使原代細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有體外增殖能力的永生化細(xì)胞株，然后通過特異性位點(diǎn)重組技術(shù)切除永生化基因，使細(xì)胞株回復(fù)到初始原代細(xì)胞的狀態(tài)[28-32]，近年來出現(xiàn)的可回復(fù)性永生化技術(shù)將條件基因敲除技術(shù)Cre/Loxp系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)相結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，提高細(xì)胞增殖能力，在擴(kuò)增培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的永生化細(xì)胞后，利用位點(diǎn)特異性酶對基因組中的永生化基因進(jìn)行再切除，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞永生化和可控回復(fù)性[33]。例如研究肝臟疾病首先需要理想的永生化肝細(xì)胞株，而傳統(tǒng)肝細(xì)胞株存在安全性及特異性功能分化較差的缺點(diǎn)，該方法為獲得理想肝細(xì)胞提供了新思路[27，34-35]。這樣不但克服了肝細(xì)胞的體外增殖，而且避免了安全性及功能分化差的缺點(diǎn)[36]。

各種細(xì)胞永生化方法比較如表1，通過表1可以看出自發(fā)突變以及化學(xué)致癌物、射線誘導(dǎo)細(xì)胞永生化缺點(diǎn)多、效果差，隨著科技的進(jìn)步，已經(jīng)逐漸被新技術(shù)取代。病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞永生化目前應(yīng)用最廣，但普遍存在安全性及特異性功能分化較差、理想永生化少、針對性較強(qiáng)等缺點(diǎn)，且永生化基因長期存留在細(xì)胞內(nèi)具有潛在的惡變風(fēng)險(xiǎn)?？苫貜?fù)性永生化既能使細(xì)胞無限增殖，又克服了細(xì)胞因永生化而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變、安全性差的缺點(diǎn)，但目前該方法只在肝細(xì)胞永生化上應(yīng)用最多。而端粒-端粒酶激活誘導(dǎo)細(xì)胞永生化可使大多數(shù)人類或動物細(xì)胞永生化，且建立的永生化細(xì)胞可保持正常細(xì)胞的生理特性，但對于某些細(xì)胞來說，只憑借該方法不足以使細(xì)胞永生化，還需要其他方法輔助進(jìn)行，利用端粒-端粒酶激活誘導(dǎo)細(xì)胞永生化是當(dāng)前細(xì)胞永生化最有效的方法。

3 永生化細(xì)胞檢測方法

體外培養(yǎng)的永生化細(xì)胞除了具有無限增殖傳代的功能以外，其他細(xì)胞特性并未發(fā)生變化。目前對永生化細(xì)胞的鑒定方法如下。

3.1 檢測永生化細(xì)胞外源基因的整合與表達(dá)

運(yùn)用DNA免疫印跡法檢測永生化細(xì)胞外源基因的整合與表達(dá)[14]，Southern-blot檢驗(yàn)外源基因在基因組中的整合情況，Northern-blot檢驗(yàn)外源基因是否能正常表達(dá)，如果可以正常表達(dá)，則會生成特異mRNA。Western-blot分析外源基因是否可以正常表達(dá)蛋白質(zhì)。鑒定某些與該外源基因有關(guān)的基因來判斷該外源基因是否具有原有的細(xì)胞特性。

3.2 端粒酶活性的檢驗(yàn)

具有較高端粒酶活性是永生化細(xì)胞的另一特點(diǎn)，通過檢驗(yàn)端粒酶活性，可以對永生化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。以人外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)為例，運(yùn)用PCR可以檢測hTERT基因整合，RT-PCR檢測hTERTmRNA表達(dá)，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測外源hTERT蛋白質(zhì)表達(dá)，可見hMSC-hTERT細(xì)胞核中存在大量黃褐色顆粒，hTERT表達(dá)呈陽性，而hMSC中hTERT表達(dá)呈陰性，證明外源hTERT已經(jīng)整合到hMSC中，并可以穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)[37]。

3.3 永生化細(xì)胞表面抗原的檢測

因其永生化細(xì)胞本有的細(xì)胞特性并未發(fā)生變化，所以永生化細(xì)胞仍有其特異的表面抗原標(biāo)記，可用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)對永生化細(xì)胞的表面抗原進(jìn)行檢測。

3.4 永生化細(xì)胞功能的檢測

誘導(dǎo)具有分化潛能的細(xì)胞體外分化，觀察其分化能力。之后通過上述方法檢測永生細(xì)胞是否具有與體內(nèi)原始細(xì)胞同樣的功能，另外，永生細(xì)胞不同于癌細(xì)胞，它不致癌，皮下注射可以用來檢測獲得的永生細(xì)胞是否致癌[17]。

4 結(jié)語與展望

細(xì)胞永生化是研究細(xì)胞增殖分化的理想模型，我們可以利用細(xì)胞永生化的各類方法使那些增殖分化困難易衰老的細(xì)胞獲得永生，從而為研究者提供更多的細(xì)胞資源。但目前仍有很多問題沒有解決，如雖然到目前為止細(xì)胞永生化的方法有很多，但是不同的細(xì)胞運(yùn)用哪種永生化方法最有效沒有明確，細(xì)胞具體的衰老機(jī)制尚未摸清等。這些尚未解決的難題，在未來有必要開展特定的細(xì)胞研究，闡明每一種細(xì)胞不同的分子機(jī)制，這對于為生物實(shí)驗(yàn)研究提供有力工具，為有效準(zhǔn)確地診斷疾病提供新道路，有著不可或缺的作用，總之細(xì)胞永生化的應(yīng)用前景廣闊，精確有效細(xì)胞永生化技術(shù)的建立對生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、組織工程等學(xué)科的發(fā)展意義重大。