春季低溫對(duì)小麥花粉育性及粒數(shù)形成的影響

高 蕓 張玉雪 馬 泉 蘇盛楠,3 李春燕,* 丁錦峰朱 敏 朱新開 郭文善

1 揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn) / 糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚(yáng)州 225009; 2 太倉(cāng)市農(nóng)業(yè)機(jī)械技術(shù)推廣站, 江蘇太倉(cāng) 215499; 3 太倉(cāng)市城廂鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)站, 江蘇太倉(cāng) 215499

溫度是影響小麥生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一, 特別是春季3、4 月低溫, 小麥正處于拔節(jié)、孕穗和開花的關(guān)鍵生育時(shí)期, 低溫嚴(yán)重影響了小麥等農(nóng)作物的生長(zhǎng)[1-3]。我國(guó)黃淮平原冬麥區(qū)河南省和山東省霜凍害一般發(fā)生頻率達(dá) 30%以上, 最高年份可達(dá)70%[4]。2016 年越冬凍害造成河南省柘城縣小麥減產(chǎn) 5%～20%, 早春凍害造成減產(chǎn)5%～30%, 晚霜凍害造成減產(chǎn)15%～60%[5]。近55年來(lái), 江蘇省倒春寒平均每年發(fā)生3.8 次, 每次平均持續(xù)時(shí)間為3.2 d, 中級(jí)以上倒春寒一般發(fā)生率達(dá)22%以上[6]。2013 年3 月江蘇省出現(xiàn)4 次寒潮和溫度急劇下降的惡劣天氣, 24 h 降溫幅度高達(dá)21.2 ℃, 最低溫度–0.7 ℃, 受災(zāi)嚴(yán)重地區(qū)興化市小麥平均減產(chǎn) 25%左右[7], 可見(jiàn)春季低溫是制約小麥生產(chǎn)的重要?dú)夂蛞蛩亍?/p>

小麥生育中后期逆境脅迫會(huì)造成小麥每穗粒數(shù)和千粒重顯著下降, 制約小麥產(chǎn)量的形成[8-9], 小麥在藥隔形成期和孕穗期遇到低溫影響更加顯著, 每穗粒數(shù)的減少與溫度的降幅和低溫持續(xù)時(shí)間成正比[10-11]; 尤其是減數(shù)分裂期是小麥低溫最敏感的時(shí)期, 該時(shí)段低溫脅迫致每穗粒數(shù)減少是產(chǎn)量下降的主要原因[12]。

小麥幼穗發(fā)育的好壞決定了穗型的大小, 其發(fā)育過(guò)程受到外界溫度的影響[13-14], 而粒數(shù)的多少往往與花粉育性和花后灌漿物質(zhì)多少有關(guān)。導(dǎo)致小麥花粉育性降低的原因很多: 低溫條件下小麥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中出現(xiàn)非同源染色體配對(duì)的異?，F(xiàn)象, 導(dǎo)致花粉敗育[12]; 低溫脅迫下植物體內(nèi)活性氧過(guò)度積累, 花藥抗氧化酶活性降低是導(dǎo)致小麥花藥敗育的又一原因[15-17]; 在不育系小麥方面的研究表明, 絨氈層程序化死亡過(guò)程的異常、花粉壁無(wú)法正常合成、以及花藥中小孢子母細(xì)胞淀粉和脂類物質(zhì)代謝異常等是溫敏核不育小麥?zhǔn)軠囟扔绊懼禄ǚ蹟∮闹饕騕18-20]。

一定強(qiáng)度的春季低溫顯著降低了小麥產(chǎn)量, 除穗數(shù)減少外, 每穗粒數(shù)下降也是減產(chǎn)的重要原因之一。但導(dǎo)致小麥粒數(shù)下降的原因是小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的異常, 還是因?yàn)榛ㄋ幹袪I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、絨氈層死亡過(guò)程的異常引起的花粉敗育, 尚沒(méi)有明確的結(jié)論。本試驗(yàn)以春性小麥品種揚(yáng)麥16和半冬性小麥品種徐麥30為材料, 在小麥倒二葉出生期、孕穗期和開花期分別進(jìn)行低溫處理, 研究春季低溫對(duì)小麥花粉育性和粒數(shù)形成的影響及其生理機(jī)制, 為提高小麥抗低溫能力、確保小麥穩(wěn)產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

供試品種為春性品種揚(yáng)麥16 和半冬性品種徐麥30, 試驗(yàn)于2015—2017 年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理實(shí)驗(yàn)室盆缽試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)用土為輕壤土, 兩年度有機(jī)質(zhì)含量平均為14.61 g kg–1, 堿解氮含量為52.35 g kg–1, 速效磷含量為37.35 g kg–1,速效鉀含量為96.51 g kg–1。采用盆栽種植, 盆缽高26 cm, 上口直徑26 cm, 底面直徑18 cm, 底部一共8 個(gè)排水孔。每盆裝土12 kg, 基施尿素0.85 g及復(fù)合肥(15% N、15% P2O5和15% K2O) 3.5 g, 澆等量水自然沉實(shí)后播種, 覆土1 kg。四葉期追施壯蘗肥, 每盆施尿素0.35 g; 葉齡余數(shù)2.5 時(shí)追施拔節(jié)肥, 每盆施尿素0.4 g 和復(fù)合肥3.33 g。2015 年于10 月31 日播種, 2016 年于11 月18 日播種, 每盆播種12 粒, 四葉期定苗, 每盆留生長(zhǎng)一致植株8 株。在人工智能控溫室中進(jìn)行低溫處理(溫度誤差±0.5 ℃, 大氣相對(duì)濕度 70%, 光量子通量密度800 μmol m–2s–1)。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于倒二葉出生期(倒二葉露尖1～2 cm)、孕穗期(劍葉全展, 劍葉與倒二葉葉枕距2～4 cm)和開花期(小麥中部小穗開出1～2 朵小花)選取生長(zhǎng)一致的盆缽分別進(jìn)行低溫處理。倒二葉出生期、孕穗期、開花期晝夜低溫分別為 5℃/–3℃、 8℃/–1℃和12℃/4℃。每個(gè)處理時(shí)間均設(shè)24 h 和48 h 兩個(gè)水平,盆缽?fù)寥浪譃樘镩g持水量的60%～70%, 處理結(jié)束后移至自然條件下生長(zhǎng)至成熟, 以室外自然生長(zhǎng)的植株為對(duì)照。

1.2 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.2.1 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察 取處于減數(shù)分裂期的麥穗(劍葉與倒二葉葉枕距為3～4 cm)中下部花藥, 用卡諾固定液固定, 置–20℃冰箱保存。試驗(yàn)時(shí)將花藥取出, 置于載玻片上, 加少許醋酸洋紅,用解剖針迅速將花藥搗碎, 蓋上蓋玻片, 在酒精燈上烤一下, 在顯微鏡下觀察, 挑選適期的花粉母細(xì)胞。在蓋玻片一側(cè)加入適量的45%醋酸, 在另一側(cè)放入吸水紙置換出染液, 使細(xì)胞質(zhì)背景顏色變淺。在液氮中放置數(shù)秒(直到聲音變?nèi)?, 用刀片迅速揭去蓋玻片, 晾干。滴加4%多聚甲醛500 μL 靜置5 min, 分別用 70%、90%和 100%酒精脫水。滴加DAPI10 μL, 蓋上蓋玻片, 壓片, 熒光顯微鏡(Olympus BX60)放大倍數(shù)為100 倍進(jìn)行觀察, 使用Olympus cellSens Dimension 軟件照相。

1.2.2 花藥細(xì)胞化學(xué)觀察 花藥細(xì)胞化學(xué)觀察方法參照李東霄[20-21]。小麥抽穗后, 取小麥中下部花藥, 一半花藥通過(guò)醋酸洋紅壓片確定二核期和三核期, 另一半用0.1 mol L–1(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液配置的含3%戊二醛固定液4℃固定8 h, 再用磷酸緩沖液漂洗3 次, 乙醇逐級(jí)脫水。用LR White 樹脂滲透、包埋、聚合。選用Leica EM UC7 型(德國(guó))超薄切片機(jī)切1.2 μm 的半薄切片, 高碘酸–希夫反應(yīng)鑒別紅色多糖物質(zhì), 考馬斯亮藍(lán)R-250 鑒別藍(lán)色蛋白質(zhì)類物質(zhì), 利用Leica DM 2500 型(德國(guó))正置生物顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3 花粉活性觀察 于開花期取麥穗中下部花藥, 采用 I2-KI 染色制片, 采用蔡司顯微鏡(Axio Imager D2 型)觀察花粉發(fā)育情況, 統(tǒng)計(jì)花粉敗育率。

1.2.4 穗部性狀調(diào)查 于成熟期每個(gè)處理取5 盆,調(diào)查每個(gè)處理每穗結(jié)實(shí)小穗數(shù)、退化小穗數(shù)、每小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)和每穗粒數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本文數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、DPS 6.55等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算、繪圖、統(tǒng)計(jì)分析。因2015—2017 兩年度小麥生長(zhǎng)季各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢(shì)基本一致, 本文重點(diǎn)以2016—2017 年數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 春季不同時(shí)期低溫對(duì)小麥花粉育性的影響

2.1.1 孕穗期低溫對(duì)小麥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響 與自然生長(zhǎng)對(duì)照小麥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I、末期I 和末期II 相比較(圖1-1～3), 孕穗期8 ℃/–1℃低溫處理48 h, 2 個(gè)品種小麥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程均觀察到減數(shù)分裂異常情況。揚(yáng)麥16 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I 出現(xiàn)多條落后染色體, 組成染色體橋(圖1-4); 在末期I 子細(xì)胞染色體排列散亂, 細(xì)胞周圍出現(xiàn)微核(圖1-5); 在末期II 細(xì)胞周圍出現(xiàn)微核(圖1-6)。徐麥30 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期后期I 出現(xiàn)染色體橋和落后染色體(圖1-7, 8); 在末期II 出現(xiàn)大小不一致的子細(xì)胞(圖1-9), 表明孕穗期低溫影響小麥花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程。

2.1.2 春季不同時(shí)期低溫對(duì)小麥花藥發(fā)育的影響

自然生長(zhǎng)的2 個(gè)品種小麥花藥中, 大液泡減小或者消失, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物積累正常, 在二胞花粉期,多糖物質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)含量逐漸增加(圖2-A, D 和圖4-A, D); 在三胞花粉期, 絨氈層降解情況較好,少有殘留的痕跡(圖3-A, D 和圖5-A, D); 在小麥倒二葉出生期和孕穗期低溫處理48 h 后, 處在二胞花粉期的花藥, 大液泡分解程度較低, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物未增加, 顆粒物較少, 淀粉和蛋白質(zhì)積累量低, 形似空殼, 花粉細(xì)胞出現(xiàn)較多不規(guī)則的畸形狀態(tài)(圖2-B, C, E, F 和圖4-B, C, E, F); 三胞花粉期絨氈層細(xì)胞明顯延遲分解, 有較多殘留(圖3-B, C, E, F 和圖5-B, C, E, F)。倒二葉出生期低溫處理后小麥花藥中淀粉和蛋白質(zhì)的積累量均低于孕穗期低溫處理, 淀粉和蛋白質(zhì)代謝異常的現(xiàn)象更顯著(圖3 和圖5)。這些結(jié)果說(shuō)明倒二葉出生期和孕穗期低溫脅迫均會(huì)導(dǎo)致花藥中淀粉、蛋白質(zhì)代謝異常和絨氈層降解延遲, 影響了小麥花粉的正常發(fā)育。2 個(gè)品種均表現(xiàn)為倒二葉出生期低溫處理對(duì)花藥淀粉和蛋白質(zhì)代謝的影響程度大于孕穗期低溫處理。

2.1.3 春季不同時(shí)期低溫對(duì)小麥花粉?；钚缘挠绊?/p>

開花期通過(guò)碘染色觀察花粉?；钚? 揚(yáng)麥16 和徐麥30 在倒二葉出生期低溫處理后敗育率最高, 變化范圍在23.6%～29.6%, 其次是孕穗期, 變化范圍在13.6%～19.8%, 開花期敗育率僅為7.0%～16.6%(表1)。3 個(gè)時(shí)期低溫處理后花粉粒敗育率均表現(xiàn)為徐麥30 高于揚(yáng)麥16, 并且隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)敗育率增加。

表1 春季不同時(shí)期低溫對(duì)小麥花粉?；钚缘挠绊慣able 1 Effects of low temperature in spring at different stages on wheat pollen activity

2.2 春季不同時(shí)期低溫對(duì)穗部性狀的影響

倒二葉出生期和孕穗期低溫脅迫后, 小麥結(jié)實(shí)小穗數(shù)和每小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)均顯著低于自然生長(zhǎng)對(duì)照, 且小穗退化百分率隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)(表2)。在兩年間, 揚(yáng)麥16 倒二葉出生期低溫處理24 h 和48 h 后平均小穗退化百分率分別為17.9%和18.7%, 孕穗期低溫處理24 h 和48 h 后平均小穗退化百分率分別為14.0%和16.4%, 開花期低溫處理?yè)P(yáng)麥16 退化小穗數(shù)略高于自然對(duì)照處理, 但無(wú)顯著差異; 徐麥30 在兩年間倒二葉出生期低溫處理24 h 和48 h 之后平均小穗退化百分率分別為22.0%和24.0%, 孕穗期低溫處理24 h 和48 h 后平均小穗退化百分率分別為19.9%和21.2%,徐麥30 開花期低溫處理導(dǎo)致退化小穗數(shù)顯著高于對(duì)照處理, 說(shuō)明徐麥30 在開花期對(duì)低溫反應(yīng)更敏感。2 個(gè)品種3 個(gè)時(shí)期低溫處理后, 每小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)均低于自然生長(zhǎng)對(duì)照處理, 且隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。相關(guān)性分析表明, 2 個(gè)品種兩年間花粉敗育率與小穗退化數(shù)均成顯著正相關(guān), 2015—2016年, 揚(yáng)麥16 相關(guān)系數(shù)0.935**, 徐麥30 相關(guān)系數(shù)0.780*, 2016—2017 年, 揚(yáng)麥16 相關(guān)系數(shù)0.848*, 徐麥30 相關(guān)系數(shù)0.980**, 退化小穗數(shù)隨著花粉敗育率的增加呈上升趨勢(shì)(圖6)。

3 討論

3.1 春季低溫對(duì)小麥花粉育性的影響

花藥的發(fā)育情況直接影響小麥粒數(shù)的形成。有研究表明, 不育小麥的花藥異常情況大多出現(xiàn)在小孢子母細(xì)胞期、單核靠邊期和二胞花粉期[22-23], 小麥劍葉與倒二葉葉耳距為0～4 cm 時(shí)幼穗中小孢子母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的盛期, 對(duì)零度以上低溫最為敏感, 低溫導(dǎo)致后期出現(xiàn)落后的染色體、后期或末期染色體仍停留在赤道板上等異?，F(xiàn)象[24]。本研究結(jié)果亦表明, 孕穗期低溫對(duì)2 個(gè)品種小麥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂有顯著影響, 低溫處理后的小麥花粉母細(xì)胞出現(xiàn)染色體配對(duì)紊亂、減數(shù)分裂染色體不同步、子細(xì)胞差異明顯等異?，F(xiàn)象。趙莎等[25]研究表明,敗育小麥農(nóng)墾58 花藥的絨氈層細(xì)胞提前啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡, 但解體過(guò)程緩慢, 使單核花粉無(wú)法獲得所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而敗育。溫敏核不育小麥花藥在二胞花粉后期, 細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)含物質(zhì)不持續(xù)增加, 淀粉粒積累終止與花粉敗育有關(guān)[20]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明, 倒二葉出生期和孕穗期低溫處理后的花藥中,絨氈層在三胞花粉時(shí)期仍有較多殘留的痕跡, 說(shuō)明絨氈層沒(méi)有適時(shí)解體, 影響了花粉發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給。同時(shí)亦觀察到2 個(gè)時(shí)期低溫處理均降低了花粉細(xì)胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量和蛋白質(zhì)的積累量, 使得花粉在發(fā)育過(guò)程中沒(méi)有充足的養(yǎng)分供應(yīng), 不能進(jìn)一步發(fā)育為成熟的花粉粒。與溫敏核不育花粉相比,本研究中低溫處理僅使花粉的內(nèi)含物質(zhì)積累量下降,并沒(méi)有出現(xiàn)非常嚴(yán)重的空泡化現(xiàn)象, 這也是低溫處理后結(jié)實(shí)率并沒(méi)有顯著下降的原因。有研究表明,小麥拔節(jié)期、孕穗期低溫顯著降低葉片的光合能力[26-27], 減少植株干物質(zhì)積累[28]。本研究中倒二葉出生期低溫處理對(duì)花藥中淀粉和蛋白質(zhì)積累的影響大于減數(shù)分裂期低溫, 這可能是由于倒二葉出生期低溫處理對(duì)葉片傷害重, 影響了葉片的光合作用,也間接影響了花粉的營(yíng)養(yǎng)供給, 導(dǎo)致花粉敗育率顯著增加; 同一時(shí)期隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng), 敗育率增高。有研究指出, 冬性小麥低溫誘導(dǎo)的抗凍害基因在從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)期的過(guò)程中表達(dá)量是顯著下降的, 遇春季低溫抗寒性下降[29], 本試驗(yàn)中2 個(gè)品種間徐麥30 敗育率大于揚(yáng)麥16, 這個(gè)結(jié)果與每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)下降的結(jié)果一致, 進(jìn)一步說(shuō)明半冬性品種徐麥30 在小麥后期低溫的敏感性高于春性品種揚(yáng)麥16。

從花藥原基分化到成熟花粉粒形成的過(guò)程中,花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂和花藥絨氈層正常發(fā)育是形成可育花粉的關(guān)鍵[30]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明, 孕穗期低溫處理后出現(xiàn)了花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常, 花藥細(xì)胞畸形以及絨氈層分解遲緩等現(xiàn)象, 花粉育性亦降低。在擬南芥中RCK 基因發(fā)生突變后同源染色體聯(lián)會(huì)和交叉紊亂, 二價(jià)體數(shù)目減少, 出現(xiàn)單價(jià)體,花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常, 導(dǎo)致花粉敗育[31]。在絨氈層發(fā)育的過(guò)程中, 多個(gè)受體蛋白激酶[32]、轉(zhuǎn)錄因子MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)結(jié)構(gòu)域蛋白[33]、鋅指蛋白中的PHD-Finger結(jié)構(gòu)域蛋白[34]等均參與調(diào)控, 小麥雄性不育與育性相關(guān)基因表達(dá)也有關(guān), 早在減數(shù)分裂期育性基因的表達(dá)就出現(xiàn)差異, 且外界溫度對(duì)不育基因表達(dá)量有調(diào)控作用[35], 本試驗(yàn)中低溫脅迫是否導(dǎo)致基因或者蛋白調(diào)控過(guò)程異常, 從而影響花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂和絨氈層的程序性死亡的啟動(dòng)致花粉敗育, 尚需從分子生物學(xué)角度開展深入研究。

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3.2 春季低溫對(duì)小麥每穗粒數(shù)的影響

春季低溫造成穗數(shù)和每穗粒數(shù)顯著下降[11,13,36]。拔節(jié)期和孕穗期低溫對(duì)穗數(shù)和每穗粒數(shù)的影響超過(guò)對(duì)粒重的影響, 特別是在孕穗期低溫處理后每穗粒數(shù)下降達(dá)55.1%, 是產(chǎn)量降低的主要原因[37]。Subedi等[38-39]研究結(jié)果表明, 抽穗后低溫顯著降了小麥結(jié)實(shí)率, 孕穗至開花期低溫導(dǎo)致小麥每穗粒數(shù)顯著下降, 產(chǎn)量下降了35%～78%。本試驗(yàn)研究結(jié)果亦表明,倒二葉出生期和孕穗期低溫均顯著降低了小麥結(jié)實(shí)小穗數(shù)和每穗粒數(shù), 增加了退化小穗數(shù), 且隨著低溫時(shí)間的延長(zhǎng), 小穗退化百分率呈上升趨勢(shì), 每穗粒數(shù)呈下降趨勢(shì)。開花期低溫略降低了結(jié)實(shí)小穗數(shù)和每穗粒數(shù)。相關(guān)分析表明花粉敗育率與退化小穗數(shù)呈顯著正相關(guān), 這也進(jìn)一步說(shuō)明倒二葉出生期和孕穗期低溫引起花粉敗育是此期低溫致每穗粒數(shù)下降的主要原因。生產(chǎn)中這2 個(gè)生育時(shí)期若發(fā)生低溫天氣值得關(guān)注, 后續(xù)將開展春季低溫的避災(zāi)減災(zāi)調(diào)控途徑研究, 以提高小麥抗春季低溫逆境能力, 實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)。

4 結(jié)論

小麥孕穗期低溫導(dǎo)致花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂出現(xiàn)染色體配對(duì)紊亂等異?，F(xiàn)象, 倒二葉出生期和孕穗期低溫延遲了花藥絨氈層的降解, 花藥中多糖物質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)的積累量下降, 花粉發(fā)育因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足敗育率增加, 開花期低溫處理花粉敗育率略有下降。3 個(gè)時(shí)期低溫處理均降低小麥每小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)和每穗粒數(shù), 并隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì), 以倒二葉出生期低溫處理穗粒數(shù)降低的幅度最大, 其次是孕穗期, 開花期穗粒數(shù)降低幅度最小。相關(guān)分析表明, 春季低溫導(dǎo)致小麥花粉育性下降是每穗粒數(shù)降低的主要生理原因。