LC－MS/MS 法研究瓜蔞薤白胃內(nèi)漂浮微丸在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征

鄢海燕，孫德考，2，鄒純才*

（1.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002；2.江蘇開元藥業(yè)有限公司，南京 222000）

瓜蔞薤白配伍使用源自張仲景的《金匱要略》，用于胸痹心痛等癥〔1〕。臨床多使用瓜蔞薤白湯治療心血管疾病〔2〕。為延長瓜蔞薤白在胃內(nèi)的滯留時間，提高生物利用度，減少患者服藥次數(shù)，改善患者依從性，課題組前期研制了瓜蔞薤白胃內(nèi)漂浮微丸（骨架型微丸，以下簡稱“瓜蔞薤白微丸”）〔3〕，瓜蔞薤白微丸中3，29-二苯甲?；闃侨嗜迹?，29-dibenzoyl-karounitriol，3，29-DK）的體外釋放度符合2015年版《中華人民共和國藥典》的要求。為進一步研究瓜蔞薤白微丸中3，29-DK 在體內(nèi)釋放情況，本研究利用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)（LC-MS/MS）法研究瓜蔞薤白微丸中3，29-DK 在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，評價瓜蔞薤白微丸在體內(nèi)的釋放效果。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料 瓜蔞薤白提取物、瓜蔞薤白微丸均由皖南醫(yī)學(xué)院藥物制劑及質(zhì)量控制課題組制備，批號分別為：20190811、20190814；對照品3，29-DK（純度≥98%）、路路通酸（純度≥98%）均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號分別為：150303、161019；甲醇為色譜醇；水為娃哈哈純凈水；其他試劑為分析純。

1.2 實驗儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent Technologies 1260 Infinity 液相色譜儀，6460 Triple QuadL C/MS，MassHunter 工作站，安捷倫公司）；JW-3021HR 高速冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；SK-1型快速混勻器（常州國華電器有限公司）。

1.3 實驗動物 SPF 級SD 大鼠12 只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，由南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供，合格證號：SCXK（蘇）2017-0001。本實驗所用動物經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

2 方法與結(jié)果

2.1 動物分組 SPF 級SD 雄性大鼠12 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機分為瓜蔞薤白微丸組（2.0 g/kg）和瓜蔞薤白提取物組（1.4 g/kg），給藥劑量為人（按60 kg計）日服用瓜蔞薤白（按25 g 計）的等效劑量，灌胃給藥，給藥前12 h 禁食不禁水。瓜蔞薤白微丸組于給藥前0 h 及給藥后第0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h 眼內(nèi)眥取血0.5 mL 于肝素鈉離心管內(nèi)，瓜蔞薤白提取物組于給藥前0 h 及給藥后第5、10、30 min，1、1.5、2、3、4、6、8 h 眼內(nèi)眥取血0.5 mL于肝素鈉離心管內(nèi)，4500 r/min 離心10 min，取血漿于試管內(nèi)，－80 ℃條件下保存。

2.2 溶液的制備

2.2.1 3，29－DK 對照品溶液 取3，29－DK 對照品適量，精密稱定，置于25 mL 容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度。臨用前，用甲醇稀釋制得濃度為600 ng/mL的3，29－DK 對照品溶液。

2.2.2 路路通酸對照品溶液 取路路通酸對照品適量，精密稱定，置于25 mL 容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度。臨用前，用甲醇稀釋制得濃度為200 ng/mL的路路通酸對照品溶液。

2.2.3 瓜蔞薤白提取物溶液 參照課題組前期研究結(jié)果〔4〕，取瓜蔞、薤白，按3∶2（g/g）混合，以10 倍量的70%乙醇回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，過濾、減壓濃縮并制備瓜蔞薤白提取物干浸膏（每克瓜蔞薤白提取物干浸膏相當(dāng)于瓜蔞薤白原藥材8 g），臨用時制備瓜蔞薤白水溶液4 g/mL（每毫升瓜蔞薤白水溶液相當(dāng)于瓜蔞薤白提取物干浸膏4 g）。

2.3 LC－MS/MS 條件 Phenomenex－C18液相色譜柱（50 mm×4.60 mm，2.6 μm），流動相：甲醇－0.1%甲酸溶液（93∶7）；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL〔5〕。

離子源：帶有安捷倫噴射流技術(shù)的電噴霧離子源（AJSESI 離子源）；檢測方式：正離子模式；干燥氣：氮氣；干燥溫度：350 ℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化器壓力：40 psi（1 psi=6.89 kPa）；毛細管電壓：4000 V〔6〕。

在全掃描（MS2 Scan）模式下3，29－DK 和路路通酸的全掃描一級質(zhì)譜圖中均含有Na+，m/z 分別為689.3 和477.2（［M+Na］+）。通過選擇離子監(jiān)測（SIM）模式分別優(yōu)化3，29－DK 和路路通酸的碰撞電壓，確定最優(yōu)碰撞電壓分別為90 V 和120 V。通過子離子模式（Product Ion Scan）分別優(yōu)化3，29－DK 和路路通酸的碰撞能量，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果得到的質(zhì)譜/ 質(zhì)譜碎片譜圖可知，最優(yōu)碰撞能量分別為45 eV 和35 eV，3，29－DK 和路路通酸的掃描離子對分別為m/z 689.3→567.2 和m/z 477.2→209.0。見圖1。

圖1 3，29－DK 及路路通酸質(zhì)譜圖

2.4 血漿樣品處理方法 取血漿、氨水溶液（pH=10） 和路路通酸對照品溶液各200 μL 渦旋混合30 s，加入2 mL 乙酸乙酯〔7〕，渦旋混合3 min，3 ℃，12000 r/min 離心5 min，取乙酸乙酯層，氮氣揮干，加入100 μL 甲醇復(fù)溶，3 ℃，12000 r/min 離心5 min，取上清液5 μL 進行LC－MS/MS 分析。

2.5 LC-MS/MS 方法學(xué)考察

2.5.1 檢測限與定量限 取“2.2”項下3，29-DK 對照品溶液（600 ng/mL）和路路通酸對照品溶液（200 ng/mL），用甲醇逐級稀釋，按“2.3”項下條件測定3，29-DK 和路路通酸的檢測限（S/N≥3）及定量限（S/N≥10）。結(jié)果顯示，3，29-DK 和路路通酸的檢測限分別為0.1、2.0 ng/mL，定量限分別為1.5、5.0 ng/mL。

2.5.2 專屬性考察 分別取空白血漿（正常大鼠的血漿）、空白血漿加混合對照品、瓜蔞薤白微丸組血漿樣品、瓜蔞薤白提取物組血漿樣品，按“2.4”項下方法處理和“2.3”項下條件進樣，結(jié)果表明，該法專屬性較好。見圖2。

圖2 專屬性考察結(jié)果圖

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取“2.2.1”項下3，29-DK對照品溶液，用甲醇梯度稀釋成6 份溶液（512、128、32、8、2、0.125 ng/mL） 并各取200 μL，氮氣揮干，分別加入空白血漿200 μL 渦旋3 min，按“2.4”項下方法處理，按“2.3”項下條件測定血漿中3，29-DK 的濃度，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3，29-DK 的濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），3，29-DK 和路路通酸峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)法（W=1/X）進行回歸運算，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.018+0.014X，r=0.9925。結(jié)果表明，3，29-DK 在0.125～512 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng) 取“2.2.1”項下3，29-DK 對照品溶液，制備512、32、2 ng/mL 的3，29-DK 對照品溶液，各取6 份，每份200 μL，備用。取空白血漿200 μL，除不加路路通酸對照品溶液外，其余按“2.4”項下方法處理，分別用512、32、2 ng/mL 的3，29-DK對照品溶液復(fù)溶，制備質(zhì)控樣品。按“2.3”項下條件進樣，計算各質(zhì)控樣品的峰面積A1與對應(yīng)濃度的3，29-DK 峰面積A2的比值，測定基質(zhì)效應(yīng)（A1/A2×100%）〔8〕。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對3，29-DK 的測定無明顯影響。見表1。

表1 基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果（±s，n=6）

表1 基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果（±s，n=6）

待測物 濃度/（ng/mL） 基質(zhì)效應(yīng)/%3，29-DK 51291.7±1.13285.4±19.6283.4±28.2

2.5.5 提取回收率 取“2.2.1”項下3，29-DK 對照品溶液，制備512、32、2 ng/mL 的3，29-DK 對照品溶液，各取6 份，每份200 μL，氮氣揮干，分別加入空白血漿200 μL 渦旋3 min，按“2.4”項下方法處理，按“2.3”項下條件進樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計算3，29-DK 的提取回收率，512、32、2 ng/mL的回收率分別為90.0%、94.4%和97.0%，平均回收率為93.8%，RSD 值為2.2%。結(jié)果表明，本法回收率較好，可滿足生物樣品的分析。

2.5.6 精密度與準(zhǔn)確度 取“2.2.1”項下3，29-DK對照品溶液，制備512、32、2 ng/mL 的3，29-DK 對照品溶液，各取6 份，每份200 μL，氮氣揮干，分別加入空白血漿200 μL 渦旋3 min，按“2.4”項下方法處理，“2.3”項下條件進樣，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算分析，得到3，29-DK 的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度〔9〕。結(jié)果表明，本法精密度及準(zhǔn)確度良好。見表2。

表2 3，29-DK 的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度結(jié)果（±s，n=6）

表2 3，29-DK 的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度結(jié)果（±s，n=6）

待測物 濃度/（ng/mL）日內(nèi)精密度RSD/%日間精密度RSD/%準(zhǔn)確度RE/%3,29-DK 5126.410.2 -8.6±6.6324.48.0 -9.0±8.125.23.5 -14.2±8.5

2.5.7 穩(wěn)定性 取“2.2.1”項下3，29-DK 對照品溶液，制備512、32、2 ng/mL 的3，29-DK 對照品溶液，各取6 份，每份200 μL，氮氣揮干，分別加入空白血漿200 μL 渦旋3 min，考察樣品在室溫條件下放置24 h、-20 ℃凍融3 次及-20 ℃凍融30 d 對3，29-DK 穩(wěn)定性的影響，按“2.4”項下方法處理，按“2.3”項下條件進樣，計算3，29－DK 峰面積，RSD 值均小于15%，符合生物樣品質(zhì)量控制要求。見表3。

表3 血漿中3，29－DK 穩(wěn)定性結(jié)果（n=6）

2.6 藥代動力學(xué)研究 血漿臨用前，按“2.4”項下方法處理，“2.3”項下條件進樣，測定各時間點血漿中3，29－DK 和路路通酸的峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算血藥濃度，采用DAS 2.0 軟件的非房室模型方法計算藥代動力學(xué)參數(shù)，SPSS 11.0 軟件進行瓜蔞薤白微丸組與瓜蔞薤白提取物組的藥代動力學(xué)參數(shù)統(tǒng)計分析。瓜蔞薤白微丸組與瓜蔞薤白提取物組血漿中3，29－DK 主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表4，藥物濃度－時間曲線見圖3。

表4 大鼠血漿中3，29－DK 的主要藥代動力學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

表4 大鼠血漿中3，29－DK 的主要藥代動力學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

注：與瓜蔞薤白提取物組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

參數(shù) 瓜蔞薤白提取物組 瓜蔞薤白微丸組AUC（0-t）/（μg/（L·h）） 422.897±20.3421317.853±181.372*AUC（0-∞）/（μg/（L·h）） 425.662±20.9871327.788±169.994*AUMC（0-t） 870.637±42.82714590.146±2412.735**AUMC（0-∞） 895.860±62.24415547.649±2522.811 MRT（0-t）/h 2.060±0.08613.078±1.060*MRT（0-∞）/h 2.106±0.11813.753±1.581*VRT（0-t）/h2 2.098±0.27658.622±22.432**VRT（0-∞）/h2 2.439±0.57288.379±53.048 t1/2 /h 0.922±0.22811.136±2.555**Tmax /h 1.000±0.0008.000±0.000**CLz/F/（L/（h·kg）） 7839.142±390.550611.482±84.728**Vz/F/（L/kg） 10403.085±2539.3685647.633±3296.164*Zeta 0.793±0.2010.062±0.039 Cz（尾點回歸值）/（μg/L） 1.824±1.2930.851±0.798 Cmax/（μg/L） 213.944±11.094142.120±14.831*

圖3 大鼠血漿中3，29－DK 藥物濃度－時間曲線（±s，n=6）

由表4、圖3 可知，與瓜蔞薤白提取物組相比，瓜蔞薤白微丸組中3，29－DK 達峰時間、AUC和t1/2顯著延長（P＜0.05），MRT顯著增加（P＜0.05），CLz/F、Cmax明顯降低（P＜0.05），表明瓜蔞薤白微丸組中3，29－DK 在大鼠體內(nèi)釋放速率較為平穩(wěn)，無突釋、速釋現(xiàn)象，代謝時間延長。

3 討論

實驗中曾嘗試用常規(guī)的甲醇、乙腈使蛋白沉淀，然后采用乙酸乙酯萃取血漿中的3，29－DK 和路路通酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉淀的蛋白嚴重包裹3，29－DK，致使血漿中3，29－DK 含量過低甚至低于檢測限，而且沉淀蛋白的樣品中雜質(zhì)較多，干擾3，29－DK 的測定。后改用乙酸乙酯直接萃取血漿中的3，29－DK，避免了蛋白沉淀包裹3，29－DK，而且雜質(zhì)干擾少。

瓜蔞薤白微丸是在瓜蔞薤白湯劑的基礎(chǔ)上研制的骨架型緩釋制劑，藥物從骨架材料中緩慢釋放從而達到緩釋效果。本實驗比較了瓜蔞薤白微丸與瓜蔞薤白提取物在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)與瓜蔞薤白提取物組相比，瓜蔞薤白微丸在大鼠體內(nèi)有緩釋效果。