UPLC-Q/Orbitrap HRMS測(cè)定白酒中氨基甲酸乙酯含量的不確定度分析

楊軍林，程平言，蔣力力，馮小兵，熊曉通，尹艷艷，胡 峰，汪地強(qiáng)，鐘方達(dá)

（貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司, 貴州遵義 564622）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）作為廣泛存在于發(fā)酵食品（乳酪、面包、酸奶等）和酒精飲料（葡萄酒、威士忌、蒸餾酒）中的2A類致癌物質(zhì)[1-3]，是威脅飲酒人群健康安全的潛在因素之一；其次，在肝臟清除上，乙醇與EC很有可能存在較為復(fù)雜的交互反應(yīng)，故攝入體內(nèi)的乙醇與EC具有一定的協(xié)同致癌效果[4]；還有證據(jù)表明，長(zhǎng)期接觸EC可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[5-6]。因此，目前有些國(guó)家已制定了EC在蒸餾酒中的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)[7-8]；但國(guó)內(nèi)尚未制定白酒中EC的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，為了有效監(jiān)測(cè)白酒中EC含量問(wèn)題，白酒生產(chǎn)企業(yè)及部分科研院所相繼開(kāi)發(fā)了薄層色譜法、傅里葉變換近紅外光譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法以及高效液相色譜-質(zhì)譜法等監(jiān)測(cè)手段[9]。為了確保實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的可信度，對(duì)其進(jìn)行測(cè)量不確定度的分析具有必要性，目前僅有氣質(zhì)聯(lián)用法的不確定度評(píng)價(jià)方法已見(jiàn)報(bào)道[10]，而高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定白酒中EC時(shí)具有前處理操作簡(jiǎn)便、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11-16]，但對(duì)其不確定度的評(píng)價(jià)研究尚屬于空白，同時(shí)，考慮了將實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度和精密度作為不確定度的來(lái)源之一。

為了客觀公正地表示測(cè)定結(jié)果，需要引入測(cè)量不確定度，測(cè)量不確定度分析是實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中的必要部分，同樣，此舉也具有相當(dāng)重要的意義。測(cè)量不確定度可有效表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，并可對(duì)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合格判定，同樣，也可用于開(kāi)發(fā)新檢測(cè)方法、實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證等方面[17-30]。本研究依據(jù)GB/T 27148-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[31]和JJF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[32]中的相關(guān)規(guī)定，結(jié)合UPLCQ/Orbitrap HRMS測(cè)定白酒中EC含量[16]的不確定度分析，以期為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)新檢測(cè)方法、CNAS認(rèn)證、質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的理論依據(jù)，同時(shí)為測(cè)量白酒中其他有毒有害物質(zhì)的不確定度分析提供參考，進(jìn)而確保實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的權(quán)威性與公正性，更好地保障白酒的食品安全與質(zhì)量品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒樣 貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司醬香成品酒；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.4%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸 色譜純，美國(guó)Fisher公司。

Q Exactive Focus 液質(zhì)聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源（HESI）及Thermo Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國(guó)Thermo Fisher公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀 美國(guó)Thermo Dionex公司；AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；艾科浦超純水機(jī) 美國(guó)Aquaplore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 參考熊曉通等[16]的試驗(yàn)方法，略作改進(jìn)，準(zhǔn)確吸取1 mL酒樣于10 mL刻度試管中，在85 ℃烘箱中烘至0.2～0.4 mL后取出，冷卻至室溫后加超純水定容至1 mL，渦旋混勻，0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后，待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析 色譜柱：AccucoreaQ 液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A為0.1%（v/v）甲酸水溶液，D為甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，維持 5% D；1～4 min，5% D 線性變至95% D；4～5.5 min，維持 95% D；5.5～6 min，95% D線性變至5% D；6～10 min，線性變至5%D。

離子源：電噴霧離子化正離子模式；掃描類型：SIM模式；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：2.3 kV；毛細(xì)管溫度：200 ℃；S-lens RF level：80；鞘氣流速：30 arb；輔助氣流速：15 arb；AGC target：1×106；一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率：70000；C-trap最大注入時(shí)間：5 ms；掃描范圍：55～95 m/z。

1.2.3 數(shù)學(xué)模型的建立 通過(guò)儀器可得標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，并經(jīng)最小二乘法線性擬合可得標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)EC質(zhì)量濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知。影響各不確定度來(lái)源之間的相關(guān)因素采取多元回歸分析，確定多個(gè)變量的因果關(guān)系，以建立預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型[20]。

白酒中EC含量計(jì)算公式見(jiàn)式（1）：

式中：X—表示試樣中EC的含量，μg/L；C—表示標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的EC的質(zhì)量濃度，ng/mL；V1—表示試樣溶液最終定容體積，mL；V0—表示試樣溶液所代表試樣的取樣體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)儀器Thermo Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合Excel軟件擬合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

依據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型，并對(duì)白酒中EC的測(cè)定結(jié)果有影響的各不確定度分量進(jìn)行全面分析和量化，如，樣品處理過(guò)程（包括樣品量取、最終定容）、標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液配制（包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合）、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、精密度、準(zhǔn)確度等，并考慮了測(cè)定儀器以及實(shí)驗(yàn)溫度變化引起的不確定度，具體引入的不確定因素如圖1所示。

圖1 白酒中EC測(cè)定不確定度因素來(lái)源分析Fig.1 Analysis of source of uncertainty factors in EC of the Chinese baijiu

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 樣品前處理及上機(jī)引起的不確定度u（C1）

2.2.1.1 量取樣品產(chǎn)生的不確定度u（V0） 用1000 μL移液器準(zhǔn)確吸取 1 mL酒樣（V0），參考 JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》[33]的要求，按B類評(píng)定，其1000 μL移液器的容量允差為±1.0%，假設(shè)按均勻分布，其不確定度是：若測(cè)量重復(fù)性為0.5%，其不確定度是：0.00289；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度是：量取樣品產(chǎn)生的不確定度和相對(duì)不確定度分別為

2.2.1.2 樣品前處理后定容引入的不確定度u（V1） 樣品經(jīng)過(guò)部分揮發(fā)后用超純水定容至V1為1 mL，按B類評(píng)定，其10 mL刻度試管的容量允差為±0.008 mL，假設(shè)按均勻分布，其不確定度是：=0.00462；若溫度波動(dòng)范圍為±5 ℃，則

2.2.1.3 儀器自動(dòng)進(jìn)樣引入的不確定度（儀器進(jìn)樣針容積）u（V2） 參考文獻(xiàn) [21,23]，UPLC-Q/Orbitrap HRMS自動(dòng)進(jìn)樣器配置的進(jìn)樣針容積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為±1%，假設(shè)按矩形分布，則0.0058。

綜上所得，合成樣品前處理及儀器自動(dòng)上機(jī)引起的相對(duì)不確定為：

2.2.2 EC質(zhì)量濃度引入的不確定度u（C2）

2.2.2.1 配制EC儲(chǔ)備液產(chǎn)生的不確定度u（C2-1）參考文獻(xiàn)[21,23]，準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品EC（m）8.0 mg（純度99.4%），超純水溶解后移至100 mL容量瓶并定容（80 mg/L）。根據(jù)EC標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)得純度（p）誤差是±0.7%，假設(shè)按均勻分布，則根據(jù)AR2140電子天平檢定證書(shū)，其最大允許誤差為±0.1 mg，假設(shè)按均勻分布，則由玻璃量器的相關(guān)規(guī)定可知[34]，在（20±5）℃ 溫度范圍下 100 mL A 級(jí)容量瓶容量允差為±0.1 mL，假設(shè)為矩形分布，則定容體積引入的不確定度：溶劑的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，假設(shè)按均勻分布，則由溫度變化引起的不確定度為：故合成100 mL容量瓶定容體積引入的相對(duì)不確定度為：因此，其配制過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

2.2.2.2 稀釋儲(chǔ)備液產(chǎn)生的不確定度u（C2-2） 用1 mL分度吸量管移取1 mL EC儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度可得質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依次稀釋可得質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按B類評(píng)定，假設(shè)按均勻分布，結(jié)合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定[34-35]，其計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 稀釋過(guò)程引入的不確定Table 1 Uncertainty arising by the dilution process

則稀釋過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

2.2.2.3 配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液產(chǎn)生的不確定度u（C2-3）用1 mL和2 mL分度吸量管移取0.2、0.5、1和2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1和1 mg/L）于10 mL容量管中并定容，可配得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液為5、10、20、50、100、200 μg/L。根據(jù)玻璃量器的檢定要求[35]，按B類評(píng)定，如表2所示。則其引入的相對(duì)不確定度為：

表2 配制過(guò)程引入的不確定度Table 2 Uncertainty arising by the configuration process

2.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u（C2-4） 參考文獻(xiàn)[20-21,25,28]，將配制的6種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液過(guò)0.22 μm水相微孔濾膜后直接上機(jī)檢測(cè)，各取10 μL分別重復(fù)進(jìn)樣3次，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度（Ci）與峰面積（Ri）間標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表3所示。取一陽(yáng)性酒樣，重復(fù)測(cè)定8次，結(jié)果見(jiàn)表4，則擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度按式（2）～式（7）計(jì)算：

表3 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Fitting standard curves

表4 陽(yáng)性酒樣測(cè)定數(shù)據(jù)Table 4 Datas of determination of positive Chinese baijiu

式中：B1為斜率；B0為截距；Ri表示第i次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中EC的峰面積；Ci表示第i次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中EC的質(zhì)量濃度；p為對(duì)陽(yáng)性酒樣的測(cè)定次數(shù)（p=8）；n為6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液重復(fù)測(cè)定3次的總次數(shù)（n=18）；C0為陽(yáng)性酒樣中EC的平均值；為 標(biāo)準(zhǔn)溶液中EC的平均質(zhì)量濃度，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度分量Table 5 Results of uncertainty arising by standard curves fitting

則由EC質(zhì)量濃度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引起的不確定度u（C3） 參考文獻(xiàn)[20,21,23]，取一已知質(zhì)量濃度的陽(yáng)性基質(zhì)樣品，添加水平為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前處理方法測(cè)定，重復(fù)測(cè)定10次，考察其重復(fù)性和回收率產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。

參考文獻(xiàn)[27-29]，取一已知質(zhì)量濃度的陽(yáng)性基質(zhì)樣品，添加水平為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前處理方法測(cè)定，通過(guò)3位分析人員分別測(cè)定待測(cè)物的質(zhì)量濃度，每人重復(fù)測(cè)定3次；同樣，取一已知質(zhì)量濃度的陽(yáng)性基質(zhì)樣品，添加水平為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前處理方法測(cè)定待測(cè)物的質(zhì)量濃度，每天重復(fù)測(cè)定3次，重復(fù)測(cè)定6 d，考察其精密度和準(zhǔn)確度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。

2.2.3.1 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u（C3-1） 通過(guò)測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)，代入公式計(jì)算可得，如表6所示。

2.2.3.2 加標(biāo)回收率R產(chǎn)生的不確定度u（C3-2） 測(cè)定加標(biāo)回收率R如表6所示，按A類評(píng)定，其回收率引入的不確定度和相對(duì)不確定度由平均回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差 S (R)的結(jié)果分別代入公式可得。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of determination of repeatability tests

2.2.3.3 測(cè)量精密度產(chǎn)生的不確定度u（C3-3） 由式（8）～式（12）計(jì)算可得精密度產(chǎn)生的不確定度和相對(duì)不確定度如表7和表8所示。

表7 不同天數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of determination by different days

式中：S (φ1)表示同一測(cè)試人員不同天數(shù)測(cè)定所得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n1為同一測(cè)試人員不同天數(shù)測(cè)定次數(shù)（n1=6×3=18）； φˉ1表示同一測(cè)試人員不同天數(shù)測(cè)定所得結(jié)果的平均值；S (φ2)表示不同測(cè)試人員同一天測(cè)定所得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n2為不同測(cè)試人員同一天測(cè)定（n2=3×3=9）；φ ˉ2表示不同測(cè)試人員同一天測(cè)定所得結(jié)果的平均值。

則由精密度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：urel（C3-3）=0.0338。

2.2.3.4 測(cè)量準(zhǔn)確度產(chǎn)生的不確定度u（C3-4） 由式（13）～式（17）計(jì)算可得準(zhǔn)確度產(chǎn)生的不確定度和相對(duì)不確定度如表7和表8所示。

表8 不同測(cè)試人員測(cè)定結(jié)果Table 8 Results of determination by different analysts

式中：S (η1)表示同一測(cè)試人員不同天數(shù)測(cè)定所得結(jié)果回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差；ηˉ1表示同一測(cè)試人員不同天數(shù)測(cè)定所得結(jié)果回收率的平均值；S (η2)表示不同測(cè)試人員同一天測(cè)定所得結(jié)果回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差；ηˉ2表示不同測(cè)試人員同一天測(cè)定所得結(jié)果回收率的平均值。

則準(zhǔn)確度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度：urel（C3-4）=0.0339。

綜上所得，由測(cè)量重復(fù)性、回收率、精密度以及準(zhǔn)確度引起的合成不確定度經(jīng)計(jì)算為：urel(C3)=

2.3 合成不確定度

若不考慮各不確定度的相關(guān)性，則結(jié)合UPLCQ/Orbitrap HRMS測(cè)定白酒中EC含量的合成不確定度由公式計(jì)算。

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

通過(guò)CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[30]和JJF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[32]的相關(guān)要求，在95%置信區(qū)間下，對(duì)于大量檢測(cè)分析均選用包含因子k=2來(lái)衡量，則由公式計(jì)算UPLC-Q/Orbitrap HRMS測(cè)定白酒中EC含量的擴(kuò)展不確定度。因此，其不確定度分析評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 UPLC-Q/Orbitrap HRMS測(cè)定白酒中EC含量的不確定度評(píng)估結(jié)果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination of EC in Chinese Baijiu by UPLC-Q/Orbitrap HRMS

3 結(jié)論

通過(guò)UPLC-Q/Orbitrap HRMS測(cè)定白酒中EC含量的不確定度評(píng)估過(guò)程可知，整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程均可或高或低的引入不確定度。本研究全面地對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、實(shí)驗(yàn)前處理過(guò)程、重復(fù)性試驗(yàn)等因素進(jìn)行綜合考慮，分析結(jié)果可知，最主要的不確定度來(lái)源從高到低依次為試驗(yàn)準(zhǔn)確度、精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，而試驗(yàn)重復(fù)性、回收率、樣品量取及體積定容引入的不確定度相對(duì)較低。故在后續(xù)試驗(yàn)操作過(guò)程中，可考慮減少人員的操作及盡量減少間隔長(zhǎng)時(shí)間測(cè)定，同時(shí)，采取增加標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，保持所用儀器良好的穩(wěn)定性能，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和使用儀器定期開(kāi)展校準(zhǔn)或檢定活動(dòng)，同時(shí)，不斷加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)員的操作技能等途徑，以達(dá)到降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的不確定度，從而實(shí)現(xiàn)新開(kāi)發(fā)方法可用性和檢測(cè)結(jié)果可信度的實(shí)驗(yàn)要求。