富含γ-氨基丁酸的黑苦蕎發(fā)芽的條件優(yōu)化及成分分析

黃思苑，羅嘉源，葉俊鋒，任運(yùn)紅，張雅甄，杜 冰,2, ，黎 攀,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 廣東廣州510642；2.云南省杜冰專家工作站, 云南普洱665008）

苦蕎作為一種天然功能食品，兼具“營養(yǎng)、保健、醫(yī)療”的作用。黑苦蕎是苦蕎的一種，因含有黃酮、多酚、蘆丁、槲皮素等多種生物活性成分而具備獨(dú)特的保健功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究成果表明，黑苦蕎具有降血壓[3]、降血脂[4]和降血糖[5]的“三降效果”，以及抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗炎[8]等多種功能作用。γ-氨基丁酸（GABA）作為黑苦蕎中常見活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜和減輕興奮[9]、調(diào)節(jié)血壓和改善大腦功能[10]。此外，GABA可以刺激胰島素的釋放，有效預(yù)防II型糖尿病[11]，還能促進(jìn)酒精代謝和抑制癌細(xì)胞增殖[12]。雖然GABA有許多重要的生理功能，但人體內(nèi)的GABA含量會因?yàn)槟挲g和外界壓力的增加而逐漸減少[13]，因此開發(fā)富含GABA的功能性食品意義重大[14]。

發(fā)芽是一種廉價而有效的加工技術(shù)，可以提高谷類和豆類的營養(yǎng)品質(zhì)?？嗍w萌發(fā)過程可以改善苦蕎籽粒的活力，提高相關(guān)酶活力及生物活性成分的含量，尤其可以積累GABA等營養(yǎng)物質(zhì)[15]。同時，發(fā)芽會降低黑苦蕎中的蛋白酶抑制劑的活性，能夠提高苦蕎蛋白質(zhì)中氨基酸的利用率[16]。據(jù)報道，谷物GABA含量與浸泡和發(fā)芽的溫度和時間息息相關(guān)[17]。目前，關(guān)于提高GABA產(chǎn)量的研究主要集中在糙米、大豆、燕麥等糧食作物中[2]，有關(guān)黑苦蕎GABA的最佳富集工藝鮮有研究。

因此，本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法探索發(fā)芽黑苦蕎中GABA富集的最佳工藝條件，進(jìn)一步提高黑苦蕎的營養(yǎng)價值和保健功能，為發(fā)芽富集GABA提供理論依據(jù)，并為發(fā)芽黑苦蕎精準(zhǔn)化營養(yǎng)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑苦蕎種子 由咀香園健康食品（中山）有限公司（中國廣東?。┨峁?；表兒茶素、γ-氨基丁酸 標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；沒食子酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究所；無水乙醚、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇、三氯化鋁、乙酸鉀、甲醇、鹽酸、次氯酸鈉等 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV759紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA2004A分析天平 上海精天電子儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市華普達(dá)數(shù)學(xué)儀器有限公司；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 京市永光明醫(yī)療儀器廠；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱，美國安捷倫公司；DGG-9070B鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ANKE TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 黑苦蕎種子浸入5%的NaClO溶液中消毒15 min，然后用蒸餾水洗滌5次，之后在15～40 ℃的蒸餾水中浸泡2～12 h。將種子置于具有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，再覆蓋3層濕潤的紗布，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在15～40 ℃和80%相對濕度的恒溫培養(yǎng)箱中放置2～7 d，以獲得發(fā)芽的黑苦蕎，在發(fā)芽過程中，每6 h更換一次紗布以保持苦蕎濕潤。制備好的發(fā)芽黑苦蕎種子與未經(jīng)過發(fā)芽處理的黑苦蕎種子都放在-80 ℃的冰箱中冷凍24 h以后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥器中，干燥48 h后，用粉碎機(jī)磨碎，60目過篩，即得到發(fā)芽前后的黑苦蕎樣品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 發(fā)芽天數(shù)對發(fā)芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發(fā)芽溫度為25 ℃、浸泡時間6 h、浸泡溫度為25 ℃、相對濕度為 85%，發(fā)芽時間分別為 1、2、3、4、5、6 d，測定發(fā)芽后苦蕎GABA的含量。

1.2.2.2 發(fā)芽溫度對發(fā)芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發(fā)芽時間為4 d、浸泡時間6 h、浸泡溫度為25 ℃、相對濕度為85%，發(fā)芽溫度分別為 15、20、25、30、35、40 ℃，測定發(fā)芽后苦蕎GABA的含量。

大多學(xué)者認(rèn)為，負(fù)面清單模式可以視為私法自治在行政法領(lǐng)域的延伸。[13]雖然我們認(rèn)可私法自治對個人權(quán)利和自由的尊崇，但私法自治仍存有一定的邊界，即不能損害公共利益和公序良俗，不能違反法律的強(qiáng)制性規(guī)定和禁止性規(guī)定，否則將受到法律的制裁。此外，市場經(jīng)濟(jì)中市場主體逐利的邊際效用與成本是對市場主體行為的內(nèi)在約束，網(wǎng)約車與負(fù)面清單模式在經(jīng)濟(jì)目標(biāo)、法律效果上同樣存在邊界的吻合。

1.2.2.3 浸泡時間對發(fā)芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發(fā)芽溫度為25 ℃、發(fā)芽時間為4 d、浸泡溫度為25 ℃、相對濕度為 85%，浸泡時間分別為 2、4、6、8、10、12、14 h，測定發(fā)芽后苦蕎GABA的含量。

1.2.2.4 浸泡溫度對發(fā)芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發(fā)芽溫度為25 ℃、發(fā)芽時間為4 d、浸泡時間6 h、相對濕度為85%，浸泡溫度分別為 15、20、25、30、35、40 ℃，測定發(fā)芽后苦蕎GABA的含量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計方案，以GABA含量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計，通過Design Expert 11軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并預(yù)測富集GABA的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Box Behnken experimental factors and levels

1.2.4 GABA含量的測定 GABA含量的測定參照NY/T 2890-2016所述的高效液相色譜法進(jìn)行測定。檢測波長 436 nm；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 10 μL；流動相A為乙腈，流動相B為質(zhì)量濃度為6.8 g/L的三水合乙酸鈉溶液；流速1.0 mL/min。GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=113.8X+170.28，R2=0.994。

1.2.5 基本成分的測定 水分測定方法按照GB 5009.3-2016食品中水分測定中所述的直接干燥法進(jìn)行測定；灰分和脂肪測定分別按照國標(biāo)GB 5009.4-2016和GB 5009.6-2016中所示的方法進(jìn)行測定；蛋白質(zhì)測定按照GB 5009.5-2016食品中蛋白質(zhì)的測定所示的凱氏定氮法進(jìn)行測定；碳水化合物的含量通過計算得到，具體計算方式為碳水化合物（g/100 g）=100-（蛋白質(zhì)+脂肪+水分+灰分）。

1.2.6 生物活性成分測定 樣品中的總黃酮含量按照NY/T 1295-2007蕎麥及制品中總黃酮含量的測定進(jìn)行測定。采用汪建飛[9]所述的福林酚法測定每個樣品的總酚含量，總酚含量用沒食子酸當(dāng)量表示。蘆丁、槲皮素、山奈酚和表兒茶素的檢測方法如下：蘆丁含量的測定方法參照《保健食品功效成分檢測方法》中所示的蘆丁的高效液相色譜測定法進(jìn)行測定；槲皮素和山奈素依照《中國藥典》中所示的方法進(jìn)行測定；表兒茶素的測定根據(jù)Jiang等[18]所述的方法進(jìn)行測定，樣品經(jīng)70%甲醇提取后，用高效液相色譜測定法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均為平行測定3次取平均值，采用Design Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與分析，數(shù)據(jù)用SPSS 25.0174軟件進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05，表示差異顯著，P＜0.01，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

圖1 不同發(fā)芽時間對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.1 Effect of different germination days on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.2 發(fā)芽溫度對黑苦蕎中GABA含量的影響 由圖2可知，發(fā)芽黑苦蕎中GABA含量隨著發(fā)芽溫度而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在15～25 ℃，苦蕎內(nèi)GABA含量逐漸增加，直至25 ℃達(dá)到最高，為33.30 mg/100 g，在高于 25 ℃后，GABA含量開始下降?？赡茉蚴菧囟绕呋蚱投紩绊懝劝彼崦擊让傅目臻g結(jié)構(gòu)及其與底物的親和力，從而引起谷氨酸脫羧酶活性下降[12]，因此，最佳發(fā)芽溫度為25 ℃。

圖2 不同發(fā)芽溫度對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.2 Effect of different germination temperature on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.3 浸泡時間對黑苦蕎中GABA含量的影響 由圖3可知，發(fā)芽黑苦蕎中GABA含量隨著浸泡時間的延長呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢，在浸泡時間為6 h時GABA含量最高，為33.0 mg/100 g。在2～6 h，苦蕎內(nèi)GABA含量快速增加，直至6 h達(dá)到頂峰，在 6～8 h，GABA 含量大幅度下降，8～12 h后 GABA含量緩慢增加但低于峰值，12 h后GABA含量后緩慢下降，本研究結(jié)果與姜秀杰等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致?？赡茉蚴呛诳嗍w浸泡過程中，GABA合成相關(guān)酶被激活，而吸水后，胚內(nèi)干物質(zhì)從凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z物質(zhì)，胚乳中的干物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì)，黑苦蕎的物質(zhì)代謝速率加快，有利于谷氨酸脫羧酶生成[20]。而在6～8 h，細(xì)胞吸水膨脹破裂，大量可溶性蛋白溶出，酶活性下降，生成GABA底物減少[13]。因此，最佳浸泡時間為6 h。

圖3 不同浸泡時間對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.3 Effect of different soaking time on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.4 浸泡溫度對黑苦蕎中GABA含量的影響 由圖4可知，黑苦蕎中GABA含量隨著浸泡溫度的升高而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在浸泡溫度為25 ℃時，黑苦蕎中的GABA含量最高，為33.40 mg/100 g。說明適當(dāng)提高浸泡溫度，有利于提高黑苦蕎GABA的含量。當(dāng)浸泡溫度過高時，GABA的含量反而出現(xiàn)下降趨勢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和梅嬋等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是溫度會影響谷物的吸漲速度，也會影響與富集GABA有關(guān)酶的活性。在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，黑苦蕎的吸水速度越快，胚乳中大分子物質(zhì)在酶的作用下分解為小分子物質(zhì)的量越多，為GABA的生成提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。當(dāng)浸泡溫度過高時，吸漲速度多快，當(dāng)吸水飽和后，會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致谷氨酸等水溶性物質(zhì)損失[14]。

圖4 不同浸泡溫度對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.4 Effect of different soaking temperature on GABA content of black tartary buckwheat

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，發(fā)芽溫度對GABA含量的影響較小，為簡化實(shí)驗(yàn)，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，選擇發(fā)芽天數(shù)、浸泡時間、浸泡溫度3個因素，以GABA含量為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)芽時間（A）、浸泡時間（B）、浸泡溫度（C）為自變量，以GABA的含量為響應(yīng)值（Y），實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果如表2所示。利用Design-Expert 11軟件對響應(yīng)面進(jìn)行設(shè)計與分析，并建立回歸模型，得出二元回歸方程為：GABA （mg/100 g）=33.46-1.16A-0.6375B+1.73C+1.10AB-0.3750AC-1.03BC-3.46A2-2.75B2-3.33C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

由表3 可知，模型F=95.13，P＜0.0001，說明模型達(dá)到了0.1%顯著水平，并且R2=0.9919、R2adj=0.9815、R2pred=0.8921、失擬項(xiàng)P=0.0611＞0.05，說明模型預(yù)測性良好且失擬程度不顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。另外，各項(xiàng)顯著性因素統(tǒng)計分析表明，其顯著性大小順序?yàn)榻轀囟龋景l(fā)芽時間＞浸泡時間。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互項(xiàng)分析 對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面見圖5。GABA的含量隨著各因素水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

圖5 各因素交互作用對黑苦蕎 GABA富集量的影響Fig.5 Effects of interaction of various factors on GABA accumulation in black tartary buckwheat

2.2.3 最優(yōu)條件的確定 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出回歸模型對發(fā)芽黑苦蕎中GABA富集量的最大預(yù)測值為33.829 mg/100 g，對應(yīng)條件為發(fā)芽時間為3.801 d、浸泡溫度26.266 ℃、浸泡時間為5.783 h，考慮到實(shí)際操作的可行性，將培養(yǎng)條件改進(jìn)為：發(fā)芽時間4 d、浸泡時間6 h、浸泡溫度25 ℃。對此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到GABA含量為33.40 mg/100 g，驗(yàn)證值與理論值的相對誤差較少，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化的條件對發(fā)芽黑苦蕎富集GABA是可行的。

2.3 黑苦蕎發(fā)芽前后的成分變化

為進(jìn)一步探究發(fā)芽對黑苦蕎成分的影響，測定在最佳發(fā)芽工藝條件下的發(fā)芽黑苦蕎與未發(fā)芽黑苦蕎的營養(yǎng)成分和活性成分的含量。

2.3.1 黑苦蕎發(fā)芽前后營養(yǎng)成分變化 對發(fā)芽前后進(jìn)行營養(yǎng)成分測定，結(jié)果見表4。發(fā)芽后，黑苦蕎的灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪的含量均有下降，而碳水化合物含量增加。王嘉怡等[22]的研究表明，糙米發(fā)芽后，灰分含量會顯著下降，本研究與其結(jié)果一致，黑苦蕎發(fā)芽后灰分含量下降可能是由于黑苦蕎在萌發(fā)過程中會激活植酸酶，植酸酶分解植酸鈣鎂等物質(zhì)后產(chǎn)生肌醇、磷酸鈣鹽和鎂鹽等可溶性的物質(zhì)，從而在浸泡和發(fā)芽的過程中損失。黑苦蕎的粗蛋白質(zhì)含量在發(fā)芽后出現(xiàn)了小幅度的減少，可能是因?yàn)楹诳嗍w在發(fā)芽的過程中激活了蛋白酶，將蛋白質(zhì)水解成了小分子的氨基酸和肽，從而導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量的下降[23]。黑苦蕎發(fā)芽后，粗脂肪含量減少，一方面可能是與脂肪水解給種子功能有關(guān)[24]，另一方面可能是脂肪在發(fā)芽的過程中發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致黑苦蕎的粗脂肪含量在發(fā)芽后有所降低[25]。巢曉玲等[15]的研究表明，在種子萌發(fā)過程中，碳水化合物由于要提供能量，含量會下降，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相反，其原因可能是本研究中碳水化合物的含量（g/100 g）=100-（蛋白質(zhì)+脂肪+水分+灰分），隨著蛋白質(zhì)、脂肪、灰分含量的減少，碳水化合物的含量會增加。

表4 黑苦蕎發(fā)芽前后營養(yǎng)成分含量（g/100 g，以干基算）Table 4 Nutrient contents of black tartary buckwheat before and after germination (g/100 g, by dry basis)

2.3.2 黑苦蕎發(fā)芽前后活性成分的變化 黃酮和多酚作為黑苦蕎中的主要活性成分，由表5可知，發(fā)芽能顯著提高黑苦蕎中總酚、總黃酮、槲皮素、山奈素、表兒茶素、綠原酸含量。發(fā)芽后，總酚含量從1.43 g/100 g 增至 2.24 g/100 g（P＜0.01），總黃酮含量從 2.12 g/100 g 增至 2.75 g/100 g（P＜0.05），槲皮素含量從 0.06 g/100 g 增至 0.12 g/100 g（P＜0.05），山奈素含量從 3.98 mg/kg增至 7.42 mg/kg（P＜0.01），表兒茶素含量從4.58 mg/kg增至50.60 mg/kg（P＜0.001），綠原酸含量從9.48 mg/kg增至153.00 mg/kg（P＜0.001）。其中表兒茶素和綠原酸的增幅最大，分別是發(fā)芽前的11.05、16.14倍?？偡印⒖傸S酮是黑苦蕎中主要的活性成分，其含量和組成是影響苦蕎種子功能和營養(yǎng)特性的重要因素。黑苦蕎發(fā)芽后，總酚和總黃酮含量顯著上升，可能的原因是苦蕎種子發(fā)芽后苯丙氨酸解氨酶的活力會增加，合成了新的多酚類化合物[16]，促使發(fā)芽后總酚含量、總黃酮含量的提高，本研究結(jié)果與鄭晨曦[17]的研究結(jié)果一致。黑苦蕎發(fā)芽后蘆丁含量下降，而槲皮素、山奈素、表兒茶素、綠原酸等黃酮類化合物含量上升，可能是因?yàn)樵诎l(fā)芽過程中，黃酮類化合物發(fā)生系列生物轉(zhuǎn)化，激活了體內(nèi)的蘆丁降解酶和苯丙氨酸解氨酶。一方面蘆丁降解酶的激活導(dǎo)致蘆丁分解合成了其他黃酮類化合物，另一方面苯丙氨酸解氨酶的活力增加導(dǎo)致多種黃酮類化合物的合成，因此蘆丁含量顯著下降，而槲皮素、山奈素等黃酮類化合物的含量顯著上升[26]。黑苦蕎發(fā)芽前后的活性成分含量對比，能有效說明發(fā)芽作為一種谷物制備的方法，可用于制備富含總酚、總黃酮、槲皮素、山奈素等生物活性成分的功能性食品。

表5 黑苦蕎發(fā)芽前后活性成分含量（以干基算）Table 5 Contents of active components in black tartary buckwheat before and after germination (by dry basis)

3 結(jié)論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，得出了黑苦蕎在發(fā)芽過程中影響其GABA含量的3個主要因素是發(fā)芽時間、浸泡時間和浸泡溫度。響應(yīng)面分析結(jié)果確定黑苦蕎最優(yōu)工藝條件為：發(fā)芽時間4 d、浸泡時間6 h、浸泡溫度25 ℃。在此條件下發(fā)芽的黑苦蕎GABA含量為33.40 mg/100 g。此外，本研究測定了發(fā)芽前后的黑苦蕎基本營養(yǎng)成分和活性成分含量，結(jié)果表明，黑苦蕎發(fā)芽后，灰分和蘆丁含量顯著下降，粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量小幅度下降，而碳水化合物、總酚、總黃酮、槲皮素、山奈素、表兒茶素、綠原酸的含量明顯上升。其中表兒茶素和綠原酸的增幅最大，分別是發(fā)芽前的11.05、16.14倍。本研究優(yōu)化和確定了富含GABA黑苦蕎的最佳發(fā)芽工藝，在此工藝下，不僅可以在較短的時間獲得高水平的GABA產(chǎn)量，也可以顯著提高黑苦蕎中的生物活性成分的含量。本研究結(jié)果為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)富含GABA的黑苦蕎新資源食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。