玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表達(dá)

蘇文英 譚一羅 劉曉梅 楊和川 秦裕營 李曉 任立凱

摘要：【目的】對(duì)玉木耳漆酶基因Aclac進(jìn)行克隆及原核表達(dá)分析，為深入研究漆酶基因在玉木耳子實(shí)體發(fā)育中的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā靠寺clac基因的cDNA和DNA全長序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并將目的基因連接至pET-28a質(zhì)粒上以構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-Aclac，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)?！窘Y(jié)果】克隆獲得的Aclac基因cDNA序列長度為1734 bp，編碼577個(gè)氨基酸殘基;Aclac基因DNA序列長度為2521 bp，含14個(gè)內(nèi)含子。AcLAC蛋白理論分子量為64.75 kD，理論等電點(diǎn)為5.70，不穩(wěn)定指數(shù)為34.01，無跨膜區(qū)域，存在1個(gè)信號(hào)肽，在4個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)高度保守，且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白與真菌的漆酶蛋白聚為一支，其中，AcLAC蛋白與木耳屬真菌的漆酶蛋白親緣關(guān)系最近。AcLAC融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)宿主中成功表達(dá)，分子量為67 kD?！窘Y(jié)論】克隆獲得的Aclac基因?qū)儆贑upredoxin超家族基因，可在原核表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)，推測(cè)其與其他真菌漆酶基因在生物學(xué)功能上具有一致性，豐富了真菌漆酶資源。

關(guān)鍵詞： 玉木耳;漆酶基因;克隆;生物信息學(xué);原核表達(dá)

中圖分類號(hào)： S646.6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）08-2158-07

Cloning and prokaryotic expression analysis of laccase gene Aclac from Auricularia cornea

SU Wen-ying1， TAN Yi-luo1， LIU Xiao-mei1， YANG He-chuan1，

QIN Yu-ying1， LI Xiao2*， REN Li-kai1*

（1Lianyungang Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang， Jiangsu ?222006， China; 2Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi， Jilin Agricultural University，

Changchun ?130118， China）

Abstract：【Objective】 The cloning and prokaryotic expression analysis of the laccase gene （Aclac） of the Auricula-ria cornea provided a basis for in-depth study of the biological function of the laccase gene in the development of the fruit body of A.cornea. 【Method】Aclac gene of A.cornea was cloned，and the full-length cDNA sequence of the gene was obtained and analyzed by bioinformatics. The target gene was also ligated to the pET-28a plasmid to construct the prokaryo-tic expression vector pET28a-Aclac， and the recombinant plasmid was induced to express in Escherichia coli BL21 （DE3）. 【Result】The cloned Aclac gene cDNA sequence was 1734 bp long，encoded 577 amino acids，DNA sequence was 2521 bp，contained 14 introns，the theoretical AcLAC protein molecular weight was 64.75 kD，the isoelectric point was 5.70，the instability index was 34.01，there was no transmembrane region，and it contained a signal peptide.it was highly conserved in 4 copper ion binding regions， and contained the conservative functional domains of the Cupredoxin superfamily protein . The results of phylogenetic analysis showed that AcLAC protein and fungal laccase protein were clustered together. Among them， AcLAC protein had the closest relationship with the Auricularia. AcLAC fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21（DE3）， and its molecular weight was 67 kD. 【Conclusion】The cloned Aclac gene belongs to the Cupredoxin superfamily gene and can be expressed heterologously in a prokaryotic expression system. It is speculated that it has the same biological function as other fungal laccase genes，and enriches fungal laccase resources.

Key words： Auricularia cornea; laccase gene; cloning; bioinformatics; prokaryotic expression

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2019YFD1001905-33）;Financial Grant Support Project of Lianyungang City（QNJJ1923）

0 引言

【研究意義】漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶（MCO）家族成員。漆酶最早被日本學(xué)者Hikorokuro（1883）在紫膠漆樹（Rhus verniciflua）分泌的汁液中發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)在真菌（Thurston，1994）、細(xì)菌（Roberts et al.，2002）和昆蟲（Dittmer et al.，2004）中也廣泛存在漆酶。其中，分泌漆酶的真菌主要有擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、子囊菌綱（Ascomycetes）、極少數(shù)半知菌綱（Deuteromycetes）及其他低等真菌（Gianfreda et al.，1999）。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已有大量的真菌漆酶基因被注釋和研究，發(fā)現(xiàn)這些漆酶在食藥用菌中發(fā)揮不同的功能，比如木質(zhì)素降解、孢子萌發(fā)、色素合成、子實(shí)體形成和植物致病性等（Zhang et al.，2015）。玉木耳是毛木耳的白色變種，作為一類重要的白腐菌，其是目前所知最有效、最主要的木質(zhì)素降解微生物。因此，對(duì)玉木耳漆酶基因克隆及表達(dá)分析，為豐富漆酶資源及探究玉木耳漆酶基因的生物學(xué)功能具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，許多真菌漆酶基因家族成員相繼被克隆，并通過采用重組技術(shù)研究漆酶基因的同源、異源表達(dá)及調(diào)控機(jī)制。Ravalason（2009）將朱紅密孔菌的漆酶基因lac1在黑曲霉中進(jìn)行融合表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)重組漆酶菌株具有生物漂白功能，能使軟木牛皮紙漿的漂白度達(dá)85% ISO。BAO等（2012）將果生鏈核盤菌的漆酶基因MfLCC2在畢赤酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及體外表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組漆酶菌株對(duì)三氯酚的降解率可達(dá)80%，故可作為處理三氯酚污染廢水的候選菌株。Yang等（2012）研究發(fā)現(xiàn)漆酶基因lac5930-1在畢赤酵母中的表達(dá)可增加谷胱甘肽水平的抗氧化活性，提高酵母對(duì)H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，刺激谷胱甘肽的抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的抵抗。裴佐蒂（2013）克隆獲得灰蓋鬼傘的漆酶基因CCLCC1Ⅰ，并在畢赤酵母中異源表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)重組漆酶菌株在發(fā)酵4 d后酶活力最高達(dá)890 mg/L，且在2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽（ABTS）作為介體的情況下，對(duì)結(jié)晶紫和孔雀石綠的降解率分別達(dá)77.7%和79.2%。Wang等（2014）克隆獲得Phomopsis liquidambari的漆酶基因lacB3，并在粟酒裂殖酵母中異源表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物rLACB3施于種植花生的土壤中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花生中的香草醛含量增加12%，但土壤中香豆酸、對(duì)羥基苯和甲酸含量分別下降21%、27%和40%，表明該漆酶在促進(jìn)花生生長中有很大潛力。鄭苗苗等（2014，2015）通過對(duì)灰樹花和紅平菇中的漆酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些重組漆酶對(duì)含蒽醌類染料的廢水處理具有很好的應(yīng)用前景。Zhuo等（2015）從Ganoderma sp. En3中克隆獲得漆酶基因lac-En3-1，并在畢赤酵母中異源表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)重組漆酶處理20 h后，孔雀綠、溴苯諾爾蘭、甲基橙和結(jié)晶紫的脫色率分別為94.1%、96.2%、80.2%和62.0%。鄭邦曉等（2015）從一株齒毛菌中克隆獲得漆酶基因Lac，并在畢赤酵母中異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組漆酶菌株在含1 mmol/L銅離子的YP培養(yǎng)基中28 ℃發(fā)酵15 d達(dá)最大酶活力（2.89 U/mL），且在乙酰丁香酮的幫助下，0.4 U/mL重組漆酶對(duì)靛類、偶氮類、三苯甲烷類等多種染料的脫色效果最佳。李杰等（2017）將鳳尾菇的漆酶基因Lac4在黑曲霉CICC2462中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組漆酶搖瓶發(fā)酵最高酶活為1211 U/L，在以ABTS作為介體的情況下可對(duì)中性紅、甲基橙及孔雀綠染料發(fā)揮降解作用，脫色率分別為13%、11%和44%，而對(duì)活性亮藍(lán)降解作用不明顯。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)毛木耳漆酶的研究主要集中在高產(chǎn)白腐菌菌株篩選、發(fā)酵優(yōu)化及漆酶對(duì)木質(zhì)素的生物降解等方面（楊建明等，2005;柏曉冉等，2020;徐安民等，2020）。原核表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)周期短、成本相對(duì)低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種重組蛋白表達(dá)。但鮮見玉木耳漆酶基因的克隆及原核表達(dá)分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆玉木耳漆酶基因Aclac的cDNA和DNA全長序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-Aclac，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，以期豐富真菌漆酶資源，為深入研究Aclac基因在玉木耳生長過程中的表達(dá)情況及漆酶基因改良菌種打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

玉木耳菌絲由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心提供。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和原核表達(dá)載體pET-28a由連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存。植物基因組DNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;UNlQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒和IPTG購自上海生工生物工程股份有限公司;Peasy-T1克隆載體、TransStart FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、EcoRⅠ和Not Ⅰ購自賽默飛世爾科技有限公司。MYG固體/液體培養(yǎng)基（葡萄糖10 g，麥芽糖5 g，酵母浸粉5 g，瓊脂粉10 g，用ddH2O定容至1000 mL），121 ℃高壓滅菌后用于復(fù)壯玉木耳菌絲。LB液體培養(yǎng)基（酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用ddH2O定容至1000 mL），121 ℃高壓滅菌后用于培養(yǎng)大腸桿菌。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 使用植物基因組DNA提取試劑盒提取玉木耳基因組DNA，具體操作步驟參照說明書進(jìn)行，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 利用UNlQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒提取玉木耳總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳及微量測(cè)定儀NanoDrop ND-1000對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒄誖evertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 基因克隆 從玉木耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得漆酶基因（Cluster-50942.6597）（楊和川等，2020），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物（Lcc-F：5?-ATGCGTTTCTCAACCAACG-3?;Lcc-R：5?-TTACAAGCCCGAATCATTCTTC-3?），委托金唯智生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。分別以玉木耳基因組DNA和cDNA為模板，利用引物L(fēng)cc-F和Lcc-R擴(kuò)增Aclac基因的DNA和cDNA全長序列。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：5×TransStart FastPfu Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL，基因組DNA（或cDNA）模板4.0 μL，上、下游引物（Lcc-F和Lcc-R）各0.5 μL、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1. 2. 4 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將目的片段與Peasy-T1克隆載體連接。連接反應(yīng)體系：Peasy-T1克隆載體1.0 μL，回收產(chǎn)物4 μL。反應(yīng)條件為25 ℃，20 min。利用熱激法將重組克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37 ℃下200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。經(jīng)菌液PCR鑒定后，挑取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 5 基因序列分析 利用DNAMAN 8.0將測(cè)序結(jié)果與參考序列（Cluster-50942.6597）進(jìn)行比對(duì)分析;通過NCBI CDD對(duì)蛋白的保守功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)。運(yùn)用PredictProtein對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);運(yùn)用ProtParam對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè);運(yùn)用TMpred預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū);運(yùn)用SignalP 5.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽;運(yùn)用SWISS-MODEL在線工具對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模;從NCBI中搜索下載有代表性的細(xì)菌及真菌漆酶蛋白的氨基酸序列，并利用MEGA 5.10的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 6 原核表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè) 用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分別酶切表達(dá)載體pET-28a和Aclac基因，利用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行同源重組連接。將重組表達(dá)載體pET28a-Aclac轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21（DE3），涂布至含100 μg/mL卡那霉素的抗性平板，挑取陽性菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃ 180 r/min在恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過夜;次日將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至含100 μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，至OD600值達(dá)0.6～0.7;加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃條件下，180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)16 h，37 ℃培養(yǎng)4 h，離心收集菌體。利用PBS緩沖液重懸菌體后，通過超聲破碎法（超聲1 s，停3 s，共10 min）破碎菌體，經(jīng)12000 r/min離心后分離上清液和沉淀。利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)AcLAC蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因克隆結(jié)果

分別以玉木耳基因組DNA和cDNA為模板擴(kuò)增獲得Aclac基因的DNA和cDNA全長序列，長度約2500和1800 bp，與預(yù)期大小基本相符（圖1）。利用DNAMAN 8.0對(duì)Aclac基因DNA和cDNA全長序列的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，克隆獲得的Aclac基因cDNA序列長度為1734 bp，編碼577個(gè)氨基酸殘基;Aclac基因DNA序列長度為2521 bp，含14個(gè)內(nèi)含子。

2. 2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

NCBI的CDD預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AcLAC蛋白含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域，表明Aclac基因?qū)儆贑upredoxin超家族基因（圖2）。ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AcLAC蛋白的分子量為64.75 kD，理論等電點(diǎn)為5.70;在體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為34.01，表明該蛋白較穩(wěn)定。PredictProtein預(yù)測(cè)結(jié)果顯示AcLAC蛋白的氨基酸組成如圖3-A所示，以亮氨酸數(shù)量最多，半胱氨酸數(shù)量最少。通過SWISS-MODEL對(duì)AcLAC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3-B所示。TMpred預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4和圖5）顯示，AcLAC蛋白不存在跨膜區(qū)，但存在1個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

由圖6可知，細(xì)菌的漆酶蛋白聚為一支;AcLAC蛋白與真菌的漆酶蛋白聚為一支，其中AcLAC蛋白與木耳屬真菌的漆酶蛋白親緣關(guān)系最近。將AcLAC蛋白與黑木耳的漆酶蛋白和lcc5序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcLAC蛋白在銅離子結(jié)合區(qū)高度保守（圖7）。

2. 3 原核表達(dá)結(jié)果

將重組表達(dá)載體pET28a-Aclac進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果（圖8）顯示目的基因成功連接至pET-28a質(zhì)粒上。對(duì)Aclac基因在大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)宿主中進(jìn)行異源表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，AcLAC融合蛋白成功表達(dá)，分子量約為67 kD，與預(yù)期結(jié)果相符。

3 討論

漆酶是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一，其中，真菌漆酶研究最廣泛和深入，目前已在60多種真菌中發(fā)現(xiàn)了漆酶，且確定其具有漆酶活性。本研究將克隆獲得的Aclac基因在NCBI進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該基因與其他真菌漆酶基因序列同源性不高。前人研究也表明，真菌漆酶的來源很多，但整體的漆酶基因序列同源性并不高，如擔(dān)子菌與子囊菌漆酶的序列相似性僅為20%～30%，但不同漆酶中銅離子結(jié)合區(qū)域相對(duì)保守（Kumar et al.，2003）。此外，漆酶基因中含有相當(dāng)多的內(nèi)含子，其中一些也高度保守（Colao et al.，2003）。Kumar等（2003）對(duì)60多個(gè)真菌漆酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)漆酶蛋白包含4個(gè)保守區(qū)域，且這4個(gè)保守區(qū)域?yàn)槠崦傅鞍椎奶卣餍蛄?。本研究將獲得的AcLAC蛋白序列與GenBank中登錄的其他真菌漆酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AcLAC蛋白序列中含有4個(gè)保守的銅離子結(jié)合區(qū)，推測(cè)不同真菌的漆酶基因在生物學(xué)功能上具有一致性。

毛木耳是一類重要的白腐菌。白腐菌是目前所知最有效、最主要的木質(zhì)素降解微生物，在工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。通過對(duì)毛木耳產(chǎn)漆酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，獲得分泌高活性漆酶的重組菌，可為木質(zhì)素酶在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用提供理論參考。楊建明等（2008）利用PCR和RACE技術(shù)首次從毛木耳中克隆獲得1個(gè)新漆酶基因的cDNA和DNA全長序列，并在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。本研究為深入探究玉木耳漆酶基因的生物學(xué)功能，從玉木耳中克隆獲得漆酶基因Aclac，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，通過原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Aclac基因進(jìn)行異源表達(dá)。但潘程遠(yuǎn)（2009）研究發(fā)現(xiàn)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)漆酶蛋白時(shí)，未檢測(cè)到活性，可能是因?yàn)槠崦甘且环N高糖基化修飾的酶，而原核表達(dá)系統(tǒng)不具備對(duì)重組蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)修飾的能力，故獲得的重組蛋白不具有漆酶活性。此外，漆酶的應(yīng)用方面存在表達(dá)困難、熱穩(wěn)定性和pH耐受性較差及酶活力較低等問題，國內(nèi)外學(xué)者則通過優(yōu)化啟動(dòng)子、信號(hào)肽及提高基因表達(dá)量和酶活力（Garg et al.，2012;Kristiina et al.，2013;Lin et al.，2013）解決這些問題。本研究僅初步對(duì)玉木耳漆酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，如何實(shí)現(xiàn)漆酶的高效異源表達(dá)及獲得高酶活力的漆酶有待深入研究。

4 結(jié)論

克隆獲得的Aclac基因?qū)儆贑upredoxin超家族基因，可在原核表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)，推測(cè)其與其他真菌漆酶基因在生物學(xué)功能上具有一致性，豐富了真菌漆酶資源。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-09-18

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFD1001905-33）;連云港市財(cái)政專項(xiàng)（QNJJ1923）

通訊作者：李曉（1976-），https：//orcid.org/0000-0003-0657-4673，副教授，主要從事食用菌教學(xué)、科研和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)研究工作，E-mail：lxmogu@163.com;任立凱（1981-），https：//orcid.org/0000-0002-9409-8840，副研究員，從事作物遺傳育種研究工作，E-mail：2949823@qq.com

第一作者：蘇文英（1992-），https：//orcid.org/0000-0002-4687-2854，主要從事食用菌遺傳育種研究工作，E-mail：18004425758@163.com