抗金銀花白粉病菌貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

黎燕珊 崔文艷 張陳芳 黃小欣 何朋杰

摘要：【目的】優(yōu)化抗金銀花白粉病菌貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，為其快速大量生產(chǎn)及進(jìn)行大田生物防治提供理論依據(jù)。【方法】以貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株為材料，采用單因素試驗和正交試驗，分別優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件;結(jié)合分生孢子萌發(fā)和平板對峙試驗，分析優(yōu)化方案下HC-8菌株對白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果及對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的拮抗活性。【結(jié)果】HC-8菌株最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為酵母蛋白胨培養(yǎng)基（YSP）;最佳培養(yǎng)基配方為蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L、麥芽糖10.0 g/L;最佳發(fā)酵條件為溫度37 ℃、初始pH 6.0、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量0.100%、裝液量20 mL/300 mL、培養(yǎng)時間48 h。優(yōu)化方案下，HC-8菌株對白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率為83.15%，顯著高于優(yōu)化前的74.65%（P<0.05，下同）;對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的抑菌率分別為60.66%、59.03%和65.32%，顯著高于優(yōu)化前的54.31%、55.24%和59.17%?！窘Y(jié)論】優(yōu)化后的方案可提高HC-8菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，并增強(qiáng)對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的拮抗效果及對白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果。建立的方案可用于快速、大批量發(fā)酵HC-8菌懸液。

關(guān)鍵詞： 金銀花;白粉病菌;貝萊斯芽孢桿菌;發(fā)酵條件;正交試驗;拮抗活性

中圖分類號： S435.67;S481.19 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2148-10

Optimization of culture medium and fermentation parameters of Bacillus velezensis HC-8 antagonistic to Erysiphe lonicerae

LI Yan-shan， CUI Wen-yan， ZHANG Chen-fang， HUANG Xiao-xin， HE Peng-jie*

（Institute of Traditional Chinese Medicine Cultivating（Breeding） and Processing Technology， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang ?550025， China）

Abstract：【Objective】To provide a theoretical basis for rapid mass production and executing field biocontrol of Bacillus velezensis HC-8 strain antagonistic to Erysiphe lonicerae， it is necessary to optimize its fermentation media and conditions. 【Method】In this study， the strain HC-8 was used as the material， and the single factor experiment and orthogonal test were employed to optimize the fermentation media and conditions; combined with conidial germination assays and plate confrontation test to analyze the inhibition effect of strain HC-8 on conidial germination of E. lonicerae and antifungal activity of strain HC-8 against Fusarium oxysporum， Phytophthora nicotianae and F. verticillioides under the optimized fermentation conditions. 【Result】The most suitable media for HC-8 strain was yeast saccharose peptone media （YSP）; the best media formula was peptone concentration of 5.0 g/L， yeast extract concentration of 25.0 g/L and maltose concentration of 10.0 g/L; and the most suitable culture conditions were the fermentation temperature of 37 ℃， the initial pH of 6.0， the shaking speed of 180 r/min， the inoculation volume of 0.100%（v/v）， the liquid medium volume of 20 mL/ 300 mL and the incubation time of 48 h. Moreover， strain HC-8 showed inhibition rates of 83.15% on E. lonicerae conidial germination under the optimized fermentation conditions， significantly higher than of 74.65% before optimization（P<0.05， the same below）. Furthermore， strain HC-8 displayed inhibition rates of 60.66%， 59.03% and 65.32% against F. oxysporum， P. nicotianae and F. verticillioides， respectively， under the optimized fermentation conditions， which were significantly higher than of 54.31%， 55.24% and 59.17% ， respectively， under the condition of before optimization. 【Conclusion】The optimized medium and fermentation conditions can effectively increase the fermentation yield and antagonistic activity of strain HC-8 against F. oxysporum， P. nicotianae and F. verticillioides， as well as the inhibition on E. lonicerae conidial germination. The optimized scheme can be used in rapid and mass production of fermented HC-8 bacterial suspension.

Key words： Lonicera japonica Thunb.; Erysiphe lonicerae; Bacillus velezensis; fermentation conditions; orthogonal test; antagonistic activity

Foundation item： Guizhou Science and Technology Support Project （QKHZC〔2020〕4Y099）; Guizhou Science and Technology Project（QKHJC-ZK〔2021〕146）; College Students Innovation and Entrepreneurship Training Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine（GZYDCHZ〔2020〕47）

0 引言

【研究意義】金銀花（Lonicera japonica Thunb.）別名二花、忍冬、鴛鴦花，是忍冬科忍冬屬植物，既可藥用，又可代茶常飲，具有抗炎解熱（王亞瓊等，2016）、抗菌（張忠斌等，2019）和保護(hù)肝臟（Miao et al.，2019）等作用，在新型冠狀病毒的預(yù)防和治療中也發(fā)揮積極作用（胡芬等，2021）。由忍冬叉絲殼菌（Microsphaera lonicerae）引起的白粉病是金銀花種植過程中的主要病害之一（吳家慶等，2014）。陳永超（2014）于2010—2013年對貴州省綏陽縣金銀花種植示范區(qū)內(nèi)的白粉病發(fā)病情況開展調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，葉片發(fā)病率為7.2%～41.7%，最高達(dá)66.4%～85.2%，花蕾發(fā)病率為4.2%～44.3%，最高達(dá)100.0%，證實(shí)白粉病已成為綏陽縣金銀花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的障礙，對金銀花種植戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，從白粉病重病田的健康金銀花葉片內(nèi)分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HC-8菌株對金銀花白粉病具有良好的生防效果，且對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌等病原真菌具有顯著的抑制作用。生防菌能否轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品并走進(jìn)實(shí)際應(yīng)用常受到多種因素影響，而發(fā)酵是一個重要的影響環(huán)節(jié)。在微生物發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件對其生長速度、菌體量及抑菌活性等均具有顯著影響。此外，相同種、屬的不同菌株的最適發(fā)酵條件由于其遺傳背景、生理特性及對生境條件的偏好性不同而存在較大差異（吳志美等，2019）。因此，明確HC-8菌株的最佳培養(yǎng)基及發(fā)酵條件對實(shí)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株的快速大量生產(chǎn)及后續(xù)應(yīng)用于金銀花白粉病大田生物防治均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，生產(chǎn)上金銀花白粉病的防治以化學(xué)防治為主，化學(xué)藥劑防治雖能起到一定的作用（夏永剛等，2012;楊帆，2017），但過量使用會引起嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留等問題（He et al.，2019），因此亟需尋找新的安全環(huán)保的防治途徑。利用選擇性強(qiáng)、綠色、無公害的生防微生物及其代謝物進(jìn)行生物防治，被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型的選擇（Li et al.，2015）。Khalaf和Raizada（2018）自南瓜種子內(nèi)分離得到169株內(nèi)生細(xì)菌，能拮抗包括白粉病菌在內(nèi)的多種常見植物病原真菌和卵菌。芽孢桿菌是一類廣泛分布于土壤、水體和動植物體內(nèi)的革蘭氏陽性細(xì)菌，由于其能高效防控白粉病等植物病害，且對人畜、環(huán)境安全無害，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和食品加工等領(lǐng)域（Cui et al.，2019;He et al.，2021）。Tanaka等（2017）研究證實(shí)貝萊斯芽孢桿菌SD-32能有效防控小麥白粉病與其誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性相關(guān)。Jiao等（2020）從煙草組織內(nèi)篩選獲得1株貝萊斯芽孢桿菌（解淀粉芽孢桿菌植物亞種）YN201732，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)YN201732菌株能高效防控?zé)煵莅追鄄　＝陙?，有關(guān)芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的報道較多，但不同菌株的最佳發(fā)酵條件存在較大差異。以芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間為例，王玲等（2014）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌L009菌株發(fā)酵的最佳條件為溫度28 ℃、培養(yǎng)時間72 h;汪晶晶等（2018）報道解淀粉芽孢桿菌GM-1-2菌株的最佳發(fā)酵條件為溫度28 ℃、培養(yǎng)時間30 h;楊可等（2019）發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌TCS001菌株的最適培養(yǎng)溫度和時間分別為25 ℃和36 h。目前，國內(nèi)外關(guān)于金銀花病害的研究報道較少，尤其是金銀花白粉病無公害防治方面的研究更少，尚未發(fā)現(xiàn)適宜應(yīng)用的生產(chǎn)型拮抗菌株，更缺乏詳細(xì)的發(fā)酵條件研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期從金銀花葉片組織中分離得到102株內(nèi)生細(xì)菌，且發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株對白粉病有良好的防治效果，但目前僅初步進(jìn)行了溫室盆栽防效驗證，尚缺乏詳細(xì)的發(fā)酵條件研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗及正交試驗方法對HC-8菌株的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件（溫度、初始pH、接種量、發(fā)酵時間、裝液量、轉(zhuǎn)速）進(jìn)行優(yōu)化，明確其最佳發(fā)酵條件;測定優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件后HC-8菌株對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉及輪狀鐮刀菌的拮抗活性，為利用生防細(xì)菌對金銀花白粉病開展生物防治研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

1. 1. 1 供試菌株 貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株為本課題組前期自金銀花植株葉片組織中分離保存。病原真菌：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）和輪狀鐮刀菌（F. verticillioides）由貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥材病害防控實(shí)驗室保存;供試白粉病菌菌株忍冬叉絲殼菌（M. lonicerae）從本課題組試驗溫室內(nèi)感染白粉病的金銀花植株葉片上分離獲得。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉6.0 g/L，pH 7.2;馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖14.0 g/L，加水至1000 mL，pH 7.2～7.4;基本培養(yǎng)基：KH2PO4 22.00 mmol/L，Na2HPO4·12H2O 33.70 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.00 mmol/L，NaC1 8.55 mmol/L，CaCl2·H2O 0.30 mmol/L，EDTA 0.17 mmol/L，F(xiàn)eCl3 0.03 mmol/L，CoCl2 0.420 ?mol/L，CuC12 0.760 ?mol/L，ZnCl2 6.200 ?mol/L，H3BO3 1.620 ?mol/L，MnCl2·4H2O 0.080 ?mol/L，biotin 0.004 ?mol/L，thaiamin-HCl 0.003 ?mol/L，NH4C1 8.93 mmol/L，碳源2.0 g/L，pH 7.0;營養(yǎng)培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L;細(xì)菌基本培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖5.0 g/L，（NH4）2SO4 2.0 g/L，檸檬酸鈉1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO4 4.0 g/L，KH2PO4 6.0 g/L;NYBD培養(yǎng)基：牛肉浸膏8.0 g/L，酵母浸膏5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L;酵母蛋白胨培養(yǎng)基（YSP）：蛋白胨2.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，蔗糖4.0 g/L。固體培養(yǎng)基的配制方法為在液體培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上加入瓊脂粉15～18 g。

1. 2 HC-8菌株種子液的制備

從-80 ℃冰箱內(nèi)取出HC-8甘油菌，在LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接種至含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的300 mL三角瓶內(nèi)，于37 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600 =0.8）。

1. 3 培養(yǎng)基種類對HC-8菌株生長速度的影響

分別向含有100 mL YSP、NYBD、NB、CM和LB培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中接入1 mL的HC-8菌株種子液，以不接種菌株為空白對照，于37 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)，24 h后用紫外分光光度計測定600 nm波長處的吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，比較HC-8菌株在不同培養(yǎng)基中的生長速度差異。

1. 4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

1. 4. 1 不同碳源對HC-8菌株生長速度的影響 向基本培養(yǎng)基中分別加入2.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇等6種不同碳源作為唯一碳源，然后分別向含有100 mL上述6種液體培養(yǎng)基的300 mL三角瓶內(nèi)接入1 mL HC-8菌株種子液，于37 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后立即取樣，測定不同碳源條件下菌液在600 nm波長處的吸光度，比較HC-8菌株在不同碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長速度差異。

1. 4. 2 不同氮源對HC-8菌株生長速度的影響 向基本培養(yǎng)基中分別加入1.4 g/L甘氨酸、蛋白胨、氯化銨、胰蛋白胨、谷氨酸和酵母膏等6種不同氮源替代原有的氯化銨作為唯一氮源，加入2.0 g/L的1.4.1中篩選出的最適碳源，于37 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后立即取樣，測定不同氮源條件下菌液在600 nm波長處的吸光度，比較HC-8菌株在不同氮源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長速度差異。

1. 4. 3 碳、氮源最佳濃度單因素試驗 以1.3中篩選出的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 g/L的1.4.1中篩選出的最適碳源取代原有碳源;分別加入1.0、3.0、5.0、7.0、9.0和11.0 g/L的1.4.2中篩選出的最佳氮源取代原有氮源，于37 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后立即取樣，測定不同條件下菌液在600 nm波長處的吸光度，比較HC-8菌株在含不同濃度碳、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長速度差異。

1. 4. 4 碳、氮源正交試驗 設(shè)計正交試驗，將從1.3～1.4.3中篩選出的適宜HC-8菌株生長的最優(yōu)培養(yǎng)基組分進(jìn)行正交試驗，進(jìn)一步確定最優(yōu)培養(yǎng)基組合。

1. 5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1. 5. 1 溫度、初始pH及發(fā)酵時間單因素試驗 采用單因素試驗研究溫度、初始pH及發(fā)酵時間對HC-8菌株生長速度的影響。溫度、初始pH及發(fā)酵時間均設(shè)7個水平，溫度設(shè)22、25、28、31、34、37和40 ℃，初始pH設(shè)4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，發(fā)酵時間設(shè)0、12、24、36、48、60和72 h，每處理3個重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后立即取樣，測定不同條件下菌液在600 nm波長處的吸光度，比較不同溫度、初始pH及發(fā)酵時間對HC-8菌株生長速度的影響。

1. 5. 2 溫度、初始pH及發(fā)酵時間正交試驗 設(shè)計L9（33）正交表，設(shè)3因素3水平正交試驗對1.5.1中篩選出的適宜HC-8菌株生長的溫度、初始pH及發(fā)酵時間進(jìn)行正交試驗，篩選HC-8菌株的最佳發(fā)酵時間、溫度和pH。

1. 5. 3 接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速單因素試驗 采用單因素試驗，研究接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速對HC-8菌株生長速度的影響。接種量設(shè)7個水平（0.050%、0.100%、0.500%、1.000%、1.500%、2.000%和2.500%），裝液量設(shè)6個水平（20、40、80、120、160和200 mL），轉(zhuǎn)速設(shè)6個水平（140、160、180、200、220和240 r/min），每處理3個重復(fù)。于37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后立即取樣，測定不同條件下菌液在600 nm波長處的吸光度，比較不同接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速對HC-8菌株生長速度的影響。

1. 5. 4 接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速正交試驗 設(shè)計L9（33）正交表，設(shè)3因素3水平正交試驗對1.5.3中篩選出的適宜HC-8菌株生長的接菌量、裝液量及轉(zhuǎn)速進(jìn)行正交試驗，篩選HC-8菌株的最佳接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速。

1. 6 室內(nèi)抗生試驗

HC-8菌株無菌發(fā)酵液制備：以1%比例將HC-8菌株種子液轉(zhuǎn)接至含有50 mL液體LB培養(yǎng)基的300 mL三角瓶內(nèi)，37 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h;或以0.1%比例將HC-8菌株種子液轉(zhuǎn)接至本研究優(yōu)化后的培養(yǎng)基中于優(yōu)化后的發(fā)酵條件下振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌離心管收集發(fā)酵液;于室溫下12000×g離心15 min，收集上清液;用細(xì)菌過濾器（0.22 μm）對上清液進(jìn)行過濾，即制得無菌發(fā)酵液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

白粉病菌分生孢子懸浮液制備：采集自然發(fā)病7～10 d的金銀花葉片置于含有12 mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中輕柔洗滌，用于收集葉片表面的白粉病菌分生孢子，然后置于5000 r/min下室溫離心5 min，棄水相收集分生孢子，借助光學(xué)顯微鏡用無菌PBS緩沖液（pH 7.0）重懸分生孢子至5×104個/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

采用瓊脂擴(kuò)散法（Cui et al.，2019）測定HC-8菌株無菌發(fā)酵液對常見植物病原真菌的拮抗活性。先用無菌打孔器（d=8 mm）在已活化好的供試病原真菌上打孔，用無菌接種針將菌塊轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基中央，采用十字交叉法在相距病原真菌菌塊3 cm處等距離擺放4個牛津杯（d=6 mm），于28 ℃下培養(yǎng)24 h后向每個牛津杯加入200 μL HC-8菌株無菌發(fā)酵液，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d后用游標(biāo)卡尺分別測量病原真菌的直徑，計算HC-8菌株對不同病原真菌的拮抗效果。每處理3次重復(fù)。

抑菌率（%）=（1-處理組真菌直徑/對照組真菌

直徑）×100

采用水瓊脂法（Jiao et al.，2020）測定HC-8菌株無菌發(fā)酵液對白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性。先配制3%水瓊脂培養(yǎng)基，高溫滅菌;倒平板前按1∶9的比例加入HC-8菌株無菌發(fā)酵液;倒板后用喉頭噴霧器將孢子懸浮液（5×104個/mL）均勻噴灑在培養(yǎng)基上。以接種PBS緩沖液為空白對照。每處理5次重復(fù)。25 ℃避光培養(yǎng)24 h，于光學(xué)顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況，每處理觀察60個視野，每個視野觀察5個分生孢子，分別計算視野內(nèi)孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。

萌發(fā)率（%）=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100

萌發(fā)抑制率（%）=（1-處理組孢子萌發(fā)率/對照

組孢子萌發(fā)率）×100

1. 7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS 26.0進(jìn)行獨(dú)立t檢驗或單因素方差分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)基種類對HC-8菌株生長速度的影響

由圖1可知，HC-8菌株在YSP、NYBD、LB、NB和CM等5種不同培養(yǎng)基中的生長速度存在顯著差異，其中在YSP培養(yǎng)基中的菌體濃度最大，OD600為2.03，顯著高于其他培養(yǎng)基處理（P<0.05，下同），因此選擇YSP培養(yǎng)基作為后續(xù)培養(yǎng)基組分優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 碳源對HC-8菌株生長速度的影響 由圖2可知，HC-8菌株分別在以麥芽糖、淀粉、蔗糖、甘露醇、乳糖和葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長速度存在顯著差異，其中以麥芽糖為碳源時菌株的濃度最大，OD600為1.59，因此選擇麥芽糖為后續(xù)單因素試驗和正交試驗的碳源。

2. 2. 2 氮源對HC-8菌株生長速度的影響 由圖3可知，HC-8菌株在以甘氨酸、谷氨酸、氯化銨、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母膏為唯一氮源的培養(yǎng)基上的生長速度存在顯著差異，其中以酵母膏處理的菌株生長最快，濃度最大，OD600為1.73，其次為蛋白胨處理，OD600為1.55，考慮到酵母膏的成分較復(fù)雜，因此同時選擇酵母膏和蛋白胨為后續(xù)單因素試驗和正交試驗的氮源。

2. 2. 3 碳源和氮源單因素試驗結(jié)果 為評估碳源和氮源等培養(yǎng)基組分對HC-8菌株生長速度的影響，分別以不同濃度的麥芽糖、蛋白胨和酵母膏代替YSP培養(yǎng)基原有相應(yīng)組分。由圖4可知，隨著麥芽糖、蛋白胨和酵母膏濃度的升高，發(fā)酵液中菌體濃度呈先升高后降低的趨勢，其中，麥芽糖、蛋白胨和酵母膏的最佳添加量分別為7.5、7.0和25.0 g/L。因此，后續(xù)3因素3水平的正交試驗中麥芽糖采用5.0、7.5和10.0 g/L、蛋白胨采用5.0、7.0和9.0 g/L、酵母膏采用15.0、20.0和25.0 g/L較合理。

2. 2. 4 碳源與氮源正交試驗結(jié)果 碳源與氮源正交試驗結(jié)果（表1）顯示RC>RB>RA，表明碳源麥芽糖含量變化對HC-8菌株生長速度影響最大，其余依次為酵母膏和蛋白胨，最佳組合為A1B3C3，即最佳培養(yǎng)基組分為蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L和麥芽糖10.0 g/L。

2. 3 HC-8菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2. 3. 1 培養(yǎng)溫度 HC-8菌株在不同培養(yǎng)溫度條件下生長速度存在顯著差異（圖5-A），隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中菌體濃度呈先逐漸升高后下降的趨勢，37 ℃時HC-8菌株生長最快，OD600為2.56，且在31～37 ℃內(nèi)生長較好，因此正交試驗選擇34、37和40 ℃ 3個水平較合理。

2. 3. 2 初始pH HC-8菌株在不同pH培養(yǎng)條件下生長速度存在顯著差異（圖5-B），隨著初始pH的升高，發(fā)酵液中菌體濃度呈先升高后降低的趨勢，其中，pH為4.0時菌株幾乎不能生長，OD600接近0;pH為5.0時HC-8菌株生長最快，OD600最大，為2.32;pH在5.0～7.0時HC-8菌株均生長較好，因此，正交試驗選擇pH為5.0、6.0和7.0 3個水平較合理。

2. 3. 3 培養(yǎng)時間 HC-8菌株在不同培養(yǎng)時間條件下生長速度存在顯著差異（圖5-C），發(fā)酵液中菌體濃度隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸上升，在培養(yǎng)時間為0～12 h時菌體數(shù)量快速增長，12 h時OD600為1.93;培養(yǎng)12 h后菌體數(shù)量增長速度放緩并逐漸趨于穩(wěn)定，其中培養(yǎng)72 h時菌體濃度最大，OD600為2.19，因此正交試驗選擇培養(yǎng)時間為48、72和96 h 3個水平較合理。

2. 3. 4 培養(yǎng)時間、溫度和初始pH正交試驗 培養(yǎng)時間、溫度和初始pH正交試驗結(jié)果（表2）顯示RB>RC>RA，說明溫度的變化對HC-8菌株生長速度影響最大，其余依次為初始pH和培養(yǎng)時間，其最佳組合為A1B2C2或A2B2C2，即HC-8菌株最佳培養(yǎng)時間為48 h或72 h、最佳溫度為37 ℃、最佳初始pH為6.0?？紤]到時間成本，在后續(xù)試驗中選擇48 h作為HC-8菌株的發(fā)酵時間。

2. 3. 5 接種量 由圖5-D可看出，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中HC-8菌株菌體濃度呈逐漸下降趨勢，但變化不大，當(dāng)接種量為0.050%時OD600最大，為2.29，因此后續(xù)正交試驗選擇0.025%、0.050%和0.100% 3個水平較合理。

2. 3. 6 裝液量 由圖5-E可看出，HC-8菌株的生長速度隨著裝液量的增加而逐漸降低，但變化不大，在300 mL的三角瓶中，當(dāng)初始裝液量為20 mL時OD600最大，為2.22，因此后續(xù)正交試驗選擇10、20和40 mL 3個水平較合理。

2. 3. 7 轉(zhuǎn)速 由圖5-F可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中菌體濃度呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時OD600達(dá)最大值，為2.74，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于或低于180 r/min時發(fā)酵液中菌體濃度均有所下降，因此后續(xù)正交試驗選擇160、180和200 r/min 3個水平較合理。

2. 3. 8 接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速正交試驗結(jié)果 接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速正交試驗結(jié)果（表3）顯示RB>RA>RC，說明裝液量對HC-8菌株生長速度的影響最大，其余依次為接種量和轉(zhuǎn)速，其最佳組合為A3B2C2，即最佳發(fā)酵條件為接種量0.100%、裝液量20 mL/300 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min。

2. 4 平板拮抗驗證結(jié)果

培養(yǎng)基組分優(yōu)化后的組合為：蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L和麥芽糖10.0 g/L，發(fā)酵條件優(yōu)化后的組合為：接種量0.100%、裝液量20 mL/300 mL、初始pH 6.0、溫度37 ℃、培養(yǎng)時間48 h、轉(zhuǎn)速180 r/min。由表4可知，優(yōu)化后HC-8菌株對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的抑菌率分別為60.66%、59.03%和65.32%，顯著高于優(yōu)化前的54.31%、55.24%和59.17%。

2. 5 白粉病菌分生孢子萌發(fā)試驗結(jié)果

處理24 h后調(diào)查分生孢子的萌發(fā)情況，結(jié)果（表5）顯示，對照處理金銀花白粉病菌分生孢子萌發(fā)率為53.78%，經(jīng)優(yōu)化后的HC-8菌株發(fā)酵液處理后白粉病菌分生孢子的萌發(fā)率為9.06%，明顯低于優(yōu)化前的13.63%;同時，優(yōu)化后HC-8菌株發(fā)酵液對白粉病菌分生孢子的萌發(fā)抑制率為83.15%，顯著高于優(yōu)化前的74.65%。

3 討論

當(dāng)前，在LB培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌類型相對單一，室內(nèi)條件下主要采用LB培養(yǎng)基來培養(yǎng)芽孢桿菌（吳海波等，2018）。本研究分別采用YSP、NYBD、LB、NB和CM培養(yǎng)基對貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株進(jìn)行搖瓶研究，結(jié)果顯示，HC-8菌株最適培養(yǎng)基為YSP培養(yǎng)基，其次為LB培養(yǎng)基，與吳志美等（2019）研究發(fā)現(xiàn)成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株的最佳培養(yǎng)基為YSP相似。

在微生物生長和發(fā)酵過程中，影響因子主要包括碳源、氮源、培養(yǎng)時間、溫度、初始pH等，但不同微生物對上述影響因子的選擇存在一定差異（鄒立飛等，2018;張穎等，2021）。本研究結(jié)果表明，HC-8菌株最適培養(yǎng)基組分為蛋白胨5.0 g/L、麥芽糖10.0 g/L和酵母膏25.0 g/L。其中，HC-8菌株的最佳碳源是麥芽糖，雖然不同碳源對HC-8菌株生長速度的影響差異顯著，但所有碳源均能被HC-8菌株以較高效率利用，說明HC-8菌株對碳源的選擇范圍較廣。相比之下，HC-8菌株對氮源的利用較偏好酵母膏、蛋白胨和胰蛋白胨，而對其他銨鹽的利用率不高，且銨態(tài)氮作為氮源時反而抑制HC-8菌株的正常生長。在發(fā)酵條件優(yōu)化方面，通過3水平3因素正交試驗分別對初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、裝液量、接種量和轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)HC-8菌株在pH為5.0～7.0時長勢較好，其最適pH為6.0，與Ye等（2017）的研究結(jié)果相近，表明該菌適合在偏弱酸性或中性環(huán)境下生長。HC-8菌株在22～40 ℃范圍內(nèi)均能生長，表明HC-8菌株對溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)，且于37 ℃下長勢最佳，而在低于31 ℃時生長較慢，表明低溫不適合該菌的發(fā)酵培養(yǎng)，與符可芯等（2020）對芽孢桿菌HNU1菌株的研究結(jié)果相似。培養(yǎng)時間對HC-8菌株生長速度影響不大，發(fā)酵12 h后即進(jìn)入穩(wěn)定生長期，且于培養(yǎng)48 h后菌液濃度最大。裝液量與發(fā)酵液的溶氧量有關(guān)，本研究正交試驗結(jié)果表明，裝液量對該菌株的生長影響較大，當(dāng)裝液量為20 mL/300 mL時HC-8菌株生長最佳。轉(zhuǎn)速和接種量也對HC-8菌株生長速度影響顯著，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min、接種量為0.100%時HC-8菌株生長情況最佳。

相同種、屬的不同菌株最適發(fā)酵條件也可能存在較大差異，可能與不同菌株的遺傳特性、生理特性及其偏好的特定生境有關(guān)（吳志美等，2019）。王玲等（2014）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌L009菌株發(fā)酵的最優(yōu)條件為溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、pH 7.0、培養(yǎng)時間72 h。汪晶晶等（2018）研究報道解淀粉芽孢桿菌GM-1-2菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖17.5 g/L、酵母膏12.5 g/L、硫酸亞鐵0.12 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH 7.0、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、pH 7.0、培養(yǎng)時間30 h、裝液量60 mL/250 mL、接種量10%。

長期以來，貝萊斯芽孢桿菌（解淀粉芽孢桿菌植物亞種）作為高效、安全的生防菌株備受人們的關(guān)注，其對多種病原菌有抑制作用（Cui et al.，2019;He et al.，2021）。侯寶宏等（2017）對從蘋果園土壤中分離出的解淀粉芽孢桿菌TS-1203研究發(fā)現(xiàn)，該菌對供試10植物病原菌均具有抑制作用;楊冬靜等（2018）從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村甘薯種植地分離篩選的貝萊斯芽孢桿菌菌株XZ-1對多種常見植物病原菌均具有抑制作用;陳照等（2019）從檳榔樹根際土壤中分離得到1株貝萊斯芽孢桿菌HAB-9菌株，研究發(fā)現(xiàn)其對17種常見病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株無菌發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌等3種病原真菌的抑制率均超過50.00%，經(jīng)培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件優(yōu)化后，對該3種病原菌的抑制效果均顯著提高。此外，HC-8是本實(shí)驗室從金銀花白粉病重病田的健康植株葉際分離得到的一株生防菌株，因其對白粉病優(yōu)異的生防效果，現(xiàn)已初步在貴州省金銀花種植區(qū)試點(diǎn)示范應(yīng)用，并取得了明顯效果。故本研究結(jié)果不僅提高了發(fā)酵液中HC-8菌株菌體濃度，降低了后續(xù)產(chǎn)業(yè)化的開發(fā)成本，還增強(qiáng)了HC-8菌株發(fā)酵液對病原真菌的拮抗作用和生防潛力，為該菌株投入大規(guī)模生產(chǎn)提供實(shí)驗依據(jù)。根據(jù)本研究結(jié)果，在后續(xù)的工作中將繼續(xù)對該菌株在金銀花植株體內(nèi)的定殖情況、抑菌與生防機(jī)制及生物制劑的開發(fā)等做進(jìn)一步研究，從而為HC-8菌株的田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株的最適培養(yǎng)基及組分為YSP培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L和麥芽糖10.0 g/L），最適合HC-8菌株生長的發(fā)酵條件為接種量0.100%、裝液量20 mL/300 mL、初始pH 6.0、溫度37 ℃、培養(yǎng)時間48 h、轉(zhuǎn)速180 r/min。優(yōu)化后的方案可提高HC-8菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，并增強(qiáng)對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的拮抗效果及對白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果。建立的方案可用于快速、大批量發(fā)酵HC-8菌懸液。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）

收稿日期：2021-08-02

基金項目：貴州省科技支撐計劃項目（黔科合支撐〔2020〕4Y099號）;貴州省科技計劃項目（黔科合基礎(chǔ)-ZK〔2021〕一般146）;貴州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（貴中醫(yī)大創(chuàng)合字〔2020〕47號）

通訊作者：何朋杰（1988-），https：//orcid.org/0000-0003-4379-9126，博士，主要從事植物病害生物防治研究工作，E-mail：gzhepj 2006@163.com

第一作者：黎燕珊（1998-），https：//orcid.org/0000-0002-0736-1576，研究方向為植物病害生物防治，E-mail： 1030042866@qq.com