支原體營養(yǎng)代謝特征的研究進展

張曉亮，郝華芳，陳勝利，顏新敏，儲岳峰

支原體(Mycoplasma)是一類缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。目前，已經(jīng)從人類和動植物體中分離出了多種致病性支原體，例如感染人類的人肺炎支原體(M.pneumonia, Mp)，在新生兒以及青少年中有極高的發(fā)病率；感染動物的如能引起山羊傳染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia, CCPP)的山羊支原體山羊肺炎亞種[1](M.capricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)和感染植物的如能引起棗瘋病(Jujube witches’-broom disease)的棗瘋病植原體(Jujubewitches’-broomphytoplasma, JWBP)等[2]，各種動植物支原體對世界畜牧業(yè)以及糧食產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，也威脅人類生命健康。

支原體基因組是環(huán)狀雙股DNA，大小480～2 200 kbp，G+C含量低，在23%～40%之間，支原體基因組中編碼氨基酸和其他各種如嘌呤，嘧啶，生物素等生長因子生物合成的基因數(shù)量很少[3]，缺乏能量代謝途徑中許多重要基因，脂肪酸和磷脂代謝基因及相關(guān)調(diào)控基因也很少[4]。因此，支原體是氨基酸、脂類和某些生長因子的營養(yǎng)缺陷型生命體，難以應(yīng)對環(huán)境的變化，僅在特定環(huán)境中生存[5]，這就造成了支原體培養(yǎng)困難。但體外培養(yǎng)是開展支原體生物學(xué)、病原學(xué)及防控技術(shù)研究的基礎(chǔ)前提，尤其由于抗藥性越來越普遍[6]，疫苗成為防治支原體病的重要方向。盡管用支原體培養(yǎng)物制造疫苗在人類和動植物支原體病防控方面取得了一些成果[7-8]，但支原體對營養(yǎng)要求高、生長緩慢和菌體密度低的特點極大阻礙了現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)效率和推廣應(yīng)用。所以，探究支原體的代謝特點，開發(fā)新培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)，是解決支原體培養(yǎng)難題的有效途徑，也是支原體研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)性問題。

本綜述總結(jié)了支原體這一具有“營養(yǎng)缺陷”特點的微生物在轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、營養(yǎng)需求以及代謝網(wǎng)絡(luò)方面的研究進展，對研發(fā)支原體高效培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基提供參考，同時希望從代謝角度對探索支原體的致病機制、毒力因子等有所啟發(fā)。

1 支原體的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

運輸系統(tǒng)被認(rèn)為在支原體的生存中起著重要作用。由于支原體的生物合成能力有限，許多營養(yǎng)物質(zhì)需要依靠外源性供給，因此支原體需要較多的運輸系統(tǒng)來運輸營養(yǎng)物質(zhì)[9]，在Mp中有17%的基因是編碼運輸過程所需的轉(zhuǎn)運蛋白或脂蛋白[10]。但與大腸桿菌和枯草桿菌相比，支原體轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量并不多，可能是由于支原體只有一個通透屏障，其運輸系統(tǒng)的底物特異性較低，且生物合成過程中耗能少等所致[11]。在支原體中已發(fā)現(xiàn)3種類型的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，即ATP結(jié)合型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(ATP-binding cassette transporter，ABC)、依賴磷酸烯醇丙酮酸的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphotransferase system，PTS)和易化擴散。

1.1 ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng) ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由胞質(zhì)中的兩個ATP結(jié)合區(qū)、兩個跨膜區(qū)和一個胞外底物結(jié)合區(qū)組成，主要參與胞內(nèi)和胞外的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，包括糖類、肽類、蛋白質(zhì)和毒素等。該系統(tǒng)的某些蛋白可以自由改變構(gòu)象，從而能相應(yīng)地改變底物的特異性和轉(zhuǎn)運功能。首先在豬鼻支原體(M.hyorhinis)和豬Mp(M.hyopneumoniae)中發(fā)現(xiàn)了ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)存在，后來在Mp(M.pneumoniae)、生殖支原體(M.genitalium)和發(fā)酵支原體(M.fermentans)中也都發(fā)現(xiàn)了ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的存在?？梢哉f，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是支原體與外界進行物質(zhì)交換的“高速公路”。近些年，對ABC轉(zhuǎn)運蛋白的研究是微生物代謝和合成生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。通過對其轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)與基因組分析，解析其具體的作用機制，探究其是否可以由一種轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運多種底物，提高微生物的代謝性能，設(shè)計出科研工作者想要的具有特定代謝性能的菌株，使其更適用于疫苗生產(chǎn)和科學(xué)研究[12-15]。2019年，Masukagami比較了野生型牛支原體和假定ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)座子突變株的代謝產(chǎn)物譜，并用13C-同位素標(biāo)記甘油轉(zhuǎn)運蛋白的突變株。發(fā)現(xiàn)突變體的兩個基因組編碼轉(zhuǎn)運蛋白的功能與基因組注釋結(jié)果不同，假定的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(mbovppg450533)似乎更有可能與運輸核苷酸有關(guān)，而假定的二羧酸/氨基酸:陽離子轉(zhuǎn)運體(mbovppg450568)更有可能起生物蝶呤/葉酸轉(zhuǎn)運體的作用。說明基因注釋的某些轉(zhuǎn)運蛋白功能與實際情況存在一定差異。進一步推測支原體的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)似乎有高度可變性，對其適應(yīng)環(huán)境和營養(yǎng)供給的變化有重要意義[16]。

1.2 PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng) PTS是大多數(shù)細(xì)菌的糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，包含對糖專一的酶II和不專一的酶I及HPr(Heat-stable histidine-phosphoryl protein，HPr)蛋白，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)山羊支原體(M.capricolum)的PTS與大腸桿菌相似，但兩者的酶II和HPr的分子結(jié)構(gòu)有差異，不存在交叉免疫反應(yīng)[17]。

對PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的酶和調(diào)節(jié)成分的活性研究是支原體代謝研究方面的主要方面，尤其對HPr和HPr激酶/磷酸化酶(HPrK/P)的生理活性研究極大地促進了各國學(xué)者對支原體PTS系統(tǒng)功能活性的了解。2004年，Halbed等人研究了Mp利用不同碳水化合物的能力及其對不同PTS組分活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加果糖或甘油時Mp的培養(yǎng)時間比添加葡萄糖時大約延長了1倍，產(chǎn)量也較低，因此葡萄糖是Mp最好的碳源。另一方面，雖然Mp基因組編碼甘露醇分解代謝所需的所有基因，但其在體外培養(yǎng)時并不能利用甘露醇。在研究中所有測試的生長條件下，PTS的酶I、HPr和HPrK/P均存在。然而，如果培養(yǎng)基中添加了甘油，HPrK/P活性會顯著增加[18]。隨后，Merzbacher等發(fā)現(xiàn)HPrK/P是Mp為數(shù)不多的調(diào)控蛋白之一，其調(diào)節(jié)方式與其他細(xì)菌有明顯不同：MpHPrK/P在低ATP濃度下就具有激酶活性，而其他細(xì)菌的HPrK/P蛋白需要高ATP濃度才能發(fā)揮出激酶活性；Mp的HPrK/P蛋白對ATP具有非常高的親和力，而果糖-1，6-二磷酸只有微弱的調(diào)節(jié)作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HPrK/P活性部位——核苷酸結(jié)合的P環(huán)的突變導(dǎo)致了MpHPrK/P獨特的調(diào)節(jié)方式，P環(huán)區(qū)域突變顯著影響ATP結(jié)合，從而影響酶的功能發(fā)揮[19]。HPrK/P缺陷的Mp突變株不再表現(xiàn)出HPr激酶活性，但仍具有針對絲氨酸磷酸化HPr的磷酸酶活性。編碼蛋白磷酸酶2C(Protein Phosphatase 2C，PP2C)家族的假定蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的基因(PrpC)可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞HPr磷酸化狀態(tài)中起重要作用[20]。總之，HPr和HPrK/P作為PTS發(fā)揮功能的重要組成部分，對支原體的能量攝取具有重要作用，通過調(diào)節(jié)HPr和HPrK/P的功能發(fā)揮來改造PTS系統(tǒng)對今后支原體的代謝乃至毒力因子[21]的研究有重要意義。

2 支原體的一般性營養(yǎng)需求

支原體的一般性營養(yǎng)需求包括碳源、氨基酸、無機鹽和水。碳源在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過一系列復(fù)雜的代謝后，成為支原體自身的細(xì)胞物質(zhì)(如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等)和代謝產(chǎn)物。碳元素占細(xì)胞干重的50%左右，因此碳源是最基本的營養(yǎng)要素，需要量大，一般的糖類、甘油等可作為支原體的碳來源。尤其是甘油代謝過程中，支原體中的3-磷酸甘油氧化過程涉及一個產(chǎn)生過氧化氫的甘油-3-磷酸氧化酶。而過氧化氫是大部分支原體的主要毒力因子之一，所以甘油代謝過程和甘油-3-磷酸氧化酶在支原體的毒力中起著關(guān)鍵作用，目前在雞毒支原體和豬Mp相關(guān)毒力研究中均有報道[22-23]。氨基酸也是支原體不可或缺的營養(yǎng)需求，不同的支原體對氨基酸的需要量也不同，但大部分支原體均需全譜氨基酸。另外，研究發(fā)現(xiàn)無機鹽也是支原體穩(wěn)定生長所需的必需物質(zhì)，Beier等發(fā)現(xiàn)為使豬Mp穩(wěn)定生長，在全組分確定的培養(yǎng)基CMRL+中添加了多種無機鹽，各種無機鹽的添加濃度和作用見表1[24]。總之，一般性營養(yǎng)需求是支原體培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 CMRL+培養(yǎng)基中添加的幾種鹽類物質(zhì)Tab.1 Several salts added in CMRL+ medium

3 支原體的特殊營養(yǎng)需求

支原體基因組很小，生物合成和代謝能力有限，因此支原體生存需要的營養(yǎng)成分主要靠從外界攝取。支原體對營養(yǎng)物質(zhì)要求苛刻，一般來講，其特殊營養(yǎng)成分主要包括：膽固醇和脂肪酸、核酸前體和能量來源。

3.1 膽固醇和脂肪酸 大多數(shù)支原體的生長需要膽固醇，因此通常在培養(yǎng)基中添加血清，目的是提供支原體生長過程中必需的膽固醇和飽和及不飽和脂肪酸[25]。牛、馬血清中所含膽固醇的主要成分是高密度脂蛋白(HDL)，并且血清中的蛋白是支原體生長所需脂肪酸的載體。由于不同動物甚至同種動物不同批號的血清所含HDL、低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)的量有差異，故其培養(yǎng)支原體的效果也有所不同[26]。到目前為止，還沒有關(guān)于支原體脂肪酶的實驗信息。然而，目前認(rèn)為脂肪酶對支原體和其他柔膜體綱物種非常重要，因為這些微生物不能合成脂肪酸，因此依賴于從環(huán)境中獲取脂肪酸。事實上，3個脂肪酶編碼基因已經(jīng)在絲狀支原體山羊亞種(M.mycoidessubsp.capri, Mmc)中被確定[27]，并且在Mp和生殖支原體的基因組中也預(yù)測了3個脂肪酶編碼基因。并且假定的脂肪酶編碼基因在Mp都是必不可少的，這表明他們是專門的底物特異性酶[28]。此外，在豬Mp中發(fā)現(xiàn)了一種偏愛較短脂肪酸的脂解酶[29]，在Mp中也存在相應(yīng)的蛋白質(zhì)(MPN407)。

由于大多數(shù)支原體都存在隱性感染的問題，難以及時診斷發(fā)現(xiàn)，目前也有諸多學(xué)者提出利用感染早期血清代謝標(biāo)志物檢測的方法來解決支原體隱性感染的問題。而血清代謝標(biāo)志物也在一定程度上反映了支原體的代謝特點，在2019年，Meera等人利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，檢測到在豬Mp早期感染的豬的血清中，發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸，棕櫚油酸，油酸和亞油酸等幾種脂肪酸的含量較未感染豬的血清中顯著上升，提示了豬Mp在機體中生長繁殖對脂肪酸具有強烈需求[30]。

3.2 核酸前體 支原體缺乏合成嘧啶所需的乳清酸代謝途徑和合成嘌呤所需的酶促代謝途徑，因此，培養(yǎng)基內(nèi)需要提供一定量的嘌呤堿和嘧啶堿。實驗證明，許多支原體的酶系統(tǒng)可以將培養(yǎng)液中的核苷酸分解為自由堿基[31]，因此可以通過核苷酸補救合成途徑合成支原體生長過程中所需要的核苷酸。

最早在1977年，Mitchell等通過試驗確定了絲狀支原體(M.mycoides)中核苷酸合成的主要途徑，發(fā)現(xiàn)其不具有從頭合成核苷酸的途徑，但能夠進行核苷酸的相互轉(zhuǎn)化，因此，尿嘧啶提供了對兩種嘧啶的需求。此外還需要胸腺嘧啶，說明其無法進行尿嘧啶的甲基化[32]。目前，在支原體核苷酸代謝研究中，公認(rèn)的是大多數(shù)支原體都缺乏核苷酸從頭合成途徑，核苷和脫氧核苷被核苷激酶和脫氧腺苷激酶有效地吸收和磷酸化為它們各自的核苷酸。核酸酶是通過次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(APRT)和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(UPRT)系統(tǒng)補救[33]。2013年，Sun和Wang在Mp基因組核苷酸生物合成中共鑒定到17種酶，其中15種是必不可少的，對30種核苷或核苷堿基類似物的藥物評價發(fā)現(xiàn)7種藥物能夠有效抑制Mp的生長，其機制是抑制了核苷酸生物合成途徑和核苷轉(zhuǎn)運蛋白中的酶[34]。支原體對外源核酸及核酸前體的需求，是支原體區(qū)別于其他微生物的重要營養(yǎng)代謝特征，而支原體對核酸的攝取造成宿主機體的損害，也是某些支原體的重要毒力因素。圖1展示了Mp中核苷酸的生物合成途徑。

Hx：次黃嘌呤，Gua：鳥嘌呤，Ura：尿嘧啶，Thy：胸腺嘧啶，dT：胸苷，dA：脫氧腺苷，dC：脫氧胞苷，dG：脫氧鳥苷，PRPP：焦磷酸核糖基，NMP：核苷一磷酸，NDP：二磷酸核苷，NTP：三磷酸核苷， dNDP：脫氧核苷二磷酸，dNTP：脫氧核苷三磷酸，TFT：三氟胸苷，TFT-MP：三氟胸苷一磷酸， TFT-TP：三氟胸苷三磷酸， 5FdU-MP：5-氟脫氧尿苷一磷酸，5FdU-TP：5-氟脫氧尿苷三磷酸， dFdC-DP：吉西他濱二磷酸， dFdC-TP：吉西他濱三磷酸， 6-TG：6-硫鳥嘌呤，6-TG-TP：6-硫鳥嘌呤三磷酸。酶：hpt：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(MPN672)，apt：腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(MPN395)，upp：尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(MPN033)，deoA：胸苷磷酸化酶(MPN064)，tdk：胸苷激酶(MPN044)，thyA：胸苷酸合酶(MPN320)，tmk：胸苷酸激酶(MPN006)，adk：腺苷酸激酶(MPN185)，gmk：鳥苷酸激酶(MPN246)，cmk：胞苷酸激酶(MPN476)，nrdE/nrdF：核糖核苷酸還原酶(MPN322和MPN324)，pyrH：尿酸激酶(MPN632)，脫氧腺苷激酶(MPN386)，I：抑制。圖1 Mp核苷酸生物合成示意圖[34]Fig.1 Schematic overview of M. pneumoniae nucleotide biosynthesis[34]

3.3 能量來源 由于缺少編碼中間代謝產(chǎn)物的基因，支原體的能量代謝系統(tǒng)比較簡單，缺乏細(xì)胞色素和三羧酸循環(huán)所需的酶類等，呼吸鏈進行不完整，因此支原體是主要依靠底物的磷酸化產(chǎn)生ATP，而不是氧化磷酸化過程。大部分支原體以葡萄糖、精氨酸以及有機酸如丙酮酸等作為能量來源。值得注意的是，雖然支原體對培養(yǎng)條件要求較高，但并非培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分越豐富，培養(yǎng)效果越好。有些較難培養(yǎng)支原體并非是缺乏相應(yīng)的營養(yǎng)成分，而是某種營養(yǎng)成分對支原體的毒性作用。如蛋白胨、酵母提取液中的某些生長因子對某些支原體而言是一種生長抑制因子。1977年，Washburn在研究中發(fā)現(xiàn)，精氨酸量的增多抑制發(fā)酵支原體和Mp的生長，因為過多的精氨酸代謝產(chǎn)生的游離堿干擾了這兩種支原體發(fā)酵葡萄糖[35]。

根據(jù)對糖類分解能力的不同，可將支原體分為發(fā)酵型和非發(fā)酵型兩種。發(fā)酵支原體主要依靠糖酵解途徑分解葡萄糖合成ATP作為能源。發(fā)酵型支原體中，以對Mp的研究居多。Mp可以利用葡萄糖、果糖和甘油作為碳源[36]。這些碳水化合物通過糖酵解分解，作為 ATP 生成的主要途徑。鑒于糖酵解對Mp的重要性，糖酵解途徑的效率對其生長至關(guān)重要。事實上，大多數(shù)Mp的糖酵解相關(guān)酶可以形成復(fù)合物，這可能對確保糖酵解途徑高通量進行起到了關(guān)鍵作用[37-38]，由于磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)缺乏氧化部分，所以糖酵解對于柔膜體綱的重要性不言而喻[39]。而在非發(fā)酵型支原體主要通過精氨酸脫氫酶、鳥氨酸甲酰轉(zhuǎn)移酶及氨基甲酸鹽激酶三個酶系統(tǒng)，將精氨酸通過底物水平磷酸化而分解成瓜氨酸、鳥氨酸、CO2、NH3及產(chǎn)生ATP而獲得能量。但是，精氨酸脫氫酶途徑在少數(shù)發(fā)酵型支原體中也存在，因此，當(dāng)培養(yǎng)這一類支原體時，如果培養(yǎng)基中同時含有葡萄糖和精氨酸，分解葡萄糖產(chǎn)生的酸可能被分解精氨酸產(chǎn)生的堿中和，使其pH不發(fā)生明顯改變，從而影響精氨酸利用試驗的結(jié)果判斷。Fenske等發(fā)現(xiàn)雞毒支原體、人型支原體和發(fā)酵支原體在含高濃度精氨酸(34 mmol/L)和低濃度精氨酸(4 mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，人型支原體菌體蛋白的含量和精氨酸脫亞胺酶的比活性在前者中都顯著增加，而雞毒支原體和發(fā)酵支原體雖然在前者中培養(yǎng)時也表現(xiàn)出蛋白含量的增加，但酶的比活性沒有增加，這說明精氨酸在某些支原體中可能作為一種替代能源使用[40]。2009年，Pereyre等發(fā)現(xiàn)人型支原體的糖酵解通路是不完整的，而精氨酸二水解酶途徑對促進其生長不可或缺，同時預(yù)測了二甲基精氨酸和二甲氨基水解酶的存在，提示精氨酸分解代謝是極其復(fù)雜的[41]。

4 支原體代謝與組學(xué)研究

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過高通量的基因組測序，蛋白質(zhì)篩選和代謝物分析，解析支原體基因組與蛋白功能，為研究支原體這類最小微生物代謝提供了更多的數(shù)據(jù)與實驗基礎(chǔ)。

2017年，Kamminga等在豬Mp基因組測序基礎(chǔ)上構(gòu)建了基于284種化學(xué)反應(yīng)和298種代謝物的基因組代謝模型，該模型預(yù)測豬Mp標(biāo)準(zhǔn)株中84%的能量用于非生長相關(guān)的生命維持，僅有16%的細(xì)胞能量用于生長和生長相關(guān)活動。發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)通過添加丙酮酸可增加用于生長的細(xì)胞能量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而使生長速率增加[42]。目前，在支原體培養(yǎng)基中添加適量丙酮酸鹽用來提高支原體的產(chǎn)量已成為各國學(xué)者的共識。同年王曉暉等[43]比較了絲狀支原體山羊亞種(Mmc)PG3菌株生長周期4個不同階段的動態(tài)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)45個差異表達(dá)基因(P<0.01)與PG3代謝相關(guān)。這些基因編碼的酶主要參與ATP合酶、嘧啶代謝、煙酸和煙酰胺代謝、精氨酸和脯氨酸代謝，其中，胞苷激酶、果糖1,6-二磷酸醛縮酶II類、煙酸-核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和二氫硫辛酰胺脫氫酶在Mmc代謝中起關(guān)鍵作用，該研究為了解Mmc代謝機制奠定了基礎(chǔ)。之后，作者又對綿羊MpNM151菌株和絲狀支原體亞種PG3菌株的不同生長階段進行了“點對點”的比較。結(jié)果表明，核苷酸代謝的最大差異出現(xiàn)在生長曲線的穩(wěn)定期。轉(zhuǎn)錄組試驗比較發(fā)現(xiàn)，PG3的核苷酸合成主要是從頭合成，而NM151核苷酸合成途徑主要是利用核苷酸的補救途徑。與 PG3相比，NM151缺乏脫氧胸腺嘧啶單磷酸酯合成的相關(guān)反應(yīng)，并通過體外添加絲氨酸來彌補這一反應(yīng)途徑的空白，延長了NM151的生長穩(wěn)定期，解決了Mo死亡較快的問題[44]。

2017年，Masukagami等使用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛支原體和雞毒支原體在代謝產(chǎn)物穩(wěn)態(tài)水平和碳源利用方面表現(xiàn)出明顯的差異。雞毒支原體積極吸收外源性葡萄糖并積累大量的磷酸己糖，隨后在糖酵解和磷酸戊糖途徑中異化，產(chǎn)生ATP，這表明其PTS系統(tǒng)和碳水化合物轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)具有高效作用。然而有趣的是，即使是在外源葡萄糖水平很高的情況下，牛支原體似乎也是主要通過糖異生途徑產(chǎn)生磷酸化糖。兩種支原體均可以吸收其他中性糖，可能是通過非特異性的碳水化合物ABC轉(zhuǎn)運蛋白CUT-2轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)的，進一步通過細(xì)胞穩(wěn)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)盡管雞毒支原體培養(yǎng)基中的糖消耗更快，但牛支原體細(xì)胞中葡萄糖和果糖的水平高于雞毒支原體細(xì)胞，推測可能是由于缺乏葡萄糖激酶同源物，牛支原體培養(yǎng)過程中外源葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)和其他糖磷酸鹽的轉(zhuǎn)化率低造成的。同時發(fā)現(xiàn)，牛支原體中乳酸含量較高，并且從培養(yǎng)基中快速吸收乳酸，這表明牛支原體可能利用乳酸作為首選的碳源，而在雞毒支原體中丙酮酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸可能是導(dǎo)致培養(yǎng)過程中pH下降的原因。牛支原體攝取乳酸不僅是為了獲取能量，也能夠氧化乳酸產(chǎn)生過氧化氫，這也是支原體的毒力因子之一，在許多支原體代謝中都存在。結(jié)果表明牛支原體優(yōu)先使用非糖類碳源，這可能反映了以反芻動物為宿主的支原體所處的生化環(huán)境，其中揮發(fā)性脂肪酸和乳酸鹽(而不是葡萄糖)是腸粘膜吸收能量的主要來源[45-49]。這是為數(shù)不多的關(guān)于動物支原體病病原的代謝組學(xué)研究，對指導(dǎo)我們了解支原體代謝提供了新的試驗參考和理論支持。

Mp是目前支原體組學(xué)方面研究最多的病原。2013年，Wodke等對Mp代謝網(wǎng)絡(luò)進行了詳細(xì)的分析和描述，并將一系列條件下不同組學(xué)分析的數(shù)據(jù)整合到一個模型中。通過模型預(yù)測、邏輯假設(shè)、實驗測試和模型細(xì)化，精確地繪制了Mp的代謝網(wǎng)絡(luò)，并對能量代謝進行了定量研究，發(fā)現(xiàn)Mp的大部分能量用于維持生命，而不是生長[50]。Maier等則進行了Mp大規(guī)模代謝組學(xué)分析以及與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的定量整合研究，檢測到超過50%的代謝中間物，得到了在實驗室生長條件下Mp代謝途徑的定性圖像，測定了體內(nèi)糖酵解酶的催化參數(shù)。同時將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)代謝物的量的大小與來自生長培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)及其相應(yīng)的形式結(jié)合起來，解釋了Mp細(xì)胞內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)維持的生化機制。揭示了Mp將代謝途徑作為功能單元進行調(diào)節(jié)，表明Mp的代謝網(wǎng)絡(luò)具有更模塊化的調(diào)節(jié)方式，極大地簡化了代謝流程中各種復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程，盡量省去不必要的能量消耗，用于維持Mp的生命和生長[51]。

5 支原體的合成生物學(xué)

支原體作為自然界目前已知的能在無生命培基中生長繁殖的最小的微生物[52]，一直是合成生物學(xué)領(lǐng)域的重點研究對象。2010年，美國J. Craig Venter團隊合成絲狀支原體(M.mycoides)基因組，然后將其移植入另一種關(guān)系密切的山羊支原體(M.capricolum)中，制造出他們稱為JCVI-syn1.0的合成細(xì)胞。2016年，研究人員在syn1.0細(xì)胞的基礎(chǔ)上,不斷嘗試刪除其基因組中不必要的基因，最終把syn1.0中901個基因刪除約一半，只剩下473個基因，合成了一個目前已知的具有最小基因組的可自主營生的最小細(xì)菌細(xì)胞，取名為JCVI-syn3.0合成細(xì)胞[53]。2019年, 美國伊利諾伊大學(xué)的Zaida Luthey-Schulten團隊又以syn3.0為基礎(chǔ)，進一步研究了這一具有最小基因組的人工生命體的必需代謝網(wǎng)絡(luò)，為進一步研究這一最小生命體奠定了基礎(chǔ)[54]。2020年，以JCVI-syn3.0為基礎(chǔ)構(gòu)建的計算機基因敲除模型以及生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)模型被設(shè)計出來[55-57]，為利用計算機技術(shù)體外重構(gòu)生命體代謝網(wǎng)絡(luò)和指導(dǎo)合成生物學(xué)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

6 結(jié) 論

支原體作為一種體外較難培養(yǎng)的微生物，從上世紀(jì)70年代各國學(xué)者都在致力于優(yōu)化其體外培養(yǎng)條件，降低體外培養(yǎng)難度和培養(yǎng)成本，尤其是致力于彌補其某些代謝通路的缺失，并期望尋找培養(yǎng)基中血清替代物從而降低其培養(yǎng)成本。同時，支原體作為一類具有最小基因組的可自主營生的微生物，可將其作為一種模式生物體外重構(gòu)基因-蛋白-代謝物網(wǎng)絡(luò)，探尋三者之間的聯(lián)系，從高通量、大數(shù)據(jù)、全局性角度為支原體的致病性研究提供數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突：無

引用本文格式：張曉亮，郝華芳，陳勝利，等.支原體營養(yǎng)代謝特征的研究進展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2021，37(11)：1029-1036. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.146