春蘭ב寒香梅’試管開花誘導(dǎo)及其生理基礎(chǔ)

曾艷華，龍薔宇，何荊洲，李秀玲，范繼征，卜朝陽

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

國蘭在我國已有一千多年栽培歷史，以其清幽、飄逸、高雅的風(fēng)姿深受國人喜愛。但國蘭育種周期長、繁育速度慢，一直是其實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。誘導(dǎo)國蘭在瓶內(nèi)開花能大幅縮短開花所需時間(從幾年縮至幾個月)，例如日本大花蕙蘭(Cymbidium hybridum)常規(guī)培育的開花時間是4～7年，誘導(dǎo)離體培養(yǎng)開花只需 3個月[1]。因此，通過體外花誘導(dǎo)可在6個月內(nèi)早期評估花色，不僅縮短了評估所需時間(至少2年)，而且降低勞動力成本，優(yōu)化傳統(tǒng)蘭花育種所需空間，對蘭花育種非常有利。近年來，國內(nèi)在槭葉蔦蘿(Ipomoea×sloteri)、鐵皮石斛(Dendrobium officinale)、龍葵(Solanum nigrum)等 41個植物品種上實現(xiàn)試管苗開花[2—3]，其中包括蘭屬的建蘭[4—6]、春蘭[7—8]、寒蘭[9]、春蘭×大花蕙蘭[10]、春劍×大花蕙蘭[11]、大花蕙蘭[1]等品種。這為試管苗開花機(jī)理研究提供了良好的證據(jù)，也充分說明植物試管苗開花具有一定的普遍性。但如此多的品種，其誘導(dǎo)開花機(jī)理仍在探索中。

植物開花是極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，受諸多因子調(diào)控[12]，其中碳水化合物和蛋白質(zhì)作為能量物質(zhì)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)在花芽分化過程中起著重要作用。本研究采用春蘭雜交品種試管苗為材料，通過試管開花條件摸索與優(yōu)化的過程，研究與探討誘導(dǎo)花芽形成及正常開花的植株生理生化變化，分析可溶性蛋白質(zhì)、可溶性總糖及參與代謝的酶類物質(zhì)與花芽分化間的關(guān)系，為建立國蘭試管開花體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試管開花誘導(dǎo)

以廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所花卉種苗組培快繁中心培養(yǎng)的春蘭ב寒香梅’(Cymbidium goeringii×C.‘Han Xiang Mei’)無菌瓶苗為試材，‘寒香梅’為春蘭集圓×越南四季蘭(C.‘JiYuan’ ×C .ensifolium)雜交種。選取高約3 cm健康瓶苗進(jìn)行開花誘導(dǎo)培養(yǎng)。試驗分生長調(diào)節(jié)劑水平、無機(jī)鹽水平和對照3組處理(表 1)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中附加瓊脂 4 g·L-1、蔗糖 20 g·L-1、椰汁 100 mL·L-1；無機(jī)鹽水平培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-16-BA，pH 5.6～5.8(表 1)。經(jīng)試驗篩選出最佳生長調(diào)節(jié)劑濃度配比和最佳 P、K含量組合，對花芽誘導(dǎo)率較高的綜合處理和對照試管苗作生理生化分析。其中綜合處理組的培養(yǎng)基配方為MS(3P,3K)+TDZ 0.2 mg·L-1+椰汁 100 mL·L-1+瓊脂 4 g·L-1+蔗糖20 g·L-1，對照組培養(yǎng)基為MS附加瓊脂和蔗糖。試驗組每瓶5株苗，每處理設(shè)50株，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照強(qiáng)度 2000 lx，光照時間 8 h·d-1。觀察記錄試管苗生長情況。

表1 試管開花誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方Table 1 Medium used as in vitro flowering induction

1.2 生理生化指標(biāo)和激素含量檢測

選取花芽誘導(dǎo)率較高的綜合處理和對照組試管苗，在培養(yǎng) 0、30、40、50、60、80 d時分別取整株(不包含原外植體莖段)測定蛋白質(zhì)、可溶性總糖含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。選用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒進(jìn)行檢測，其中蛋白質(zhì)使用BCA法測定，SOD活性采用NBT法測定。每處理重復(fù)3次。

選取花芽誘導(dǎo)率較高的綜合處理和對照組試管苗在培養(yǎng)0、20、40、60、80 d時分別取整株苗測定內(nèi)源激素吲哚乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)，每處理3次重復(fù)。IAA和ABA檢測采用液質(zhì)聯(lián)用法，色譜柱：C18 柱(2.1 mm × 100 mm，1.9 μm)；色譜分離條件：柱溫 25 ℃，流動相 A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL；質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源(ESI)正、負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM模式)。

1.3 統(tǒng)計指標(biāo)與數(shù)據(jù)分析

花芽誘導(dǎo)率/%=分化花芽的植株數(shù)/供試植株數(shù)×100%；

利用 SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，處理間的差異性多重比較采用LSD分析；采用Origin 7.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交春蘭試管開花誘導(dǎo)

2.1.1 兩種生長調(diào)節(jié)劑不同濃度配比對花芽誘導(dǎo)的影響

在接種后第40天開始觀察，直到第80天，統(tǒng)計花芽總數(shù)和發(fā)育狀況。不同濃度6-BA和TDZ的花芽誘導(dǎo)率見表2。其中，使用5號和3號培養(yǎng)基，即添加0.2 mg·L-1TDZ或2.0 mg·L-16-BA的 MS培養(yǎng)基花芽誘導(dǎo)率最高，兩者差異不顯著，花芽能正常發(fā)育成花苞，但不能正常開花(圖1: B, C)。4號和6號培養(yǎng)基的花芽誘導(dǎo)率較高，但發(fā)育畸形，頂端發(fā)育多頭花芽(圖1: D)。2號培養(yǎng)基(1.5 mg·L-16-BA)誘導(dǎo)花芽花梗較長，從營養(yǎng)葉中抽出，之后能正常發(fā)育開花，其萼片、捧瓣的形狀、色澤接近溫室培養(yǎng)的正?；ú啃誀?圖1: A, E)，但誘導(dǎo)率極低 。1號培養(yǎng)基和CK1未能誘導(dǎo)出花芽，但CK1誘導(dǎo)出較多的根(圖1: F)。

表2 不同激素濃度配比對花芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different hormone concentrations on flower bud induction

圖1 添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基花芽誘導(dǎo)情況Fig. 1 Flower bud induction in different hormone concentration medium

2.1.2 不同P、K含量培養(yǎng)基對花芽誘導(dǎo)的影響

在接種后第40天至第80天統(tǒng)計花芽總數(shù)和發(fā)育狀況。不同P、K含量培養(yǎng)基花芽誘導(dǎo)率見表3。其中，8號和9號培養(yǎng)基，即3P/3K和3P/5K培養(yǎng)基誘導(dǎo)花芽數(shù)量最多，兩者之間差異不顯著，與 7號培養(yǎng)基誘導(dǎo)率差異極顯著，花芽均能正常發(fā)育，但未能正常開花，花苞在接種80 d后逐漸變黃枯萎，誘導(dǎo)效果與3號、5號培養(yǎng)基類似。CK2植株生長緩慢，能誘導(dǎo)少量花芽和根。

表3 不同P、K含量對花芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different P, K content on flower bud induction

2.1.3 綜合處理的花芽誘導(dǎo)率

綜合上述花芽誘導(dǎo)率較高的處理因素，設(shè)計對照組和綜合處理組實驗。接種后，第20天開始，每隔20 d統(tǒng)計一次花芽誘導(dǎo)率(表4)。結(jié)果表明，在接種后，對照組未能成功分化花芽，誘導(dǎo)率為 0，而綜合處理組在第40天時開始形成花芽，花芽誘導(dǎo)率為10%左右；第60天增至22%，第80天誘導(dǎo)率達(dá)最高，為34%左右。同時，與上述培養(yǎng)基第80天的誘導(dǎo)率相比，綜合處理組的花芽誘導(dǎo)率極顯著增高。

表4 綜合處理對花芽誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of comprehensive treatment on flower bud induction

此外，在實驗中觀察發(fā)現(xiàn)，雖然綜合處理組的花芽誘導(dǎo)比對照組時間短，誘導(dǎo)率高，但植株長勢較差，綜合處理組的部分嫩芽、新葉呈紫紅色或蒼白，而對照組植株長勢較好且健壯，葉片較大且更綠，能舒展開來。

2.2 花芽誘導(dǎo)過程中生理生化變化

2.2.1 蛋白質(zhì)、可溶性總糖含量與超氧化物歧化酶活性分析

在花芽誘導(dǎo)20 d、40 d、60 d、80 d、100 d時測定可溶性蛋白質(zhì)、可溶性總糖、超氧化物歧化酶三種生理指標(biāo)。由圖2可見，綜合處理組和對照組三個指標(biāo)整體上均呈先上升后下降的趨勢，且基本在60 d時達(dá)峰值，并顯著高于對照組。對比各時期花芽誘導(dǎo)率來看，40～60 d是誘導(dǎo)率增加最快的時段，60～80 d花芽誘導(dǎo)數(shù)量仍有增加，但增速放緩。說明可溶性蛋白、可溶性總糖含量及SOD活性與花芽誘導(dǎo)有一定的正相關(guān)。多數(shù)花苞后期不能正常開放，以致枯萎發(fā)黃，可能與后期生理指標(biāo)持續(xù)下降有關(guān)。

圖2 花芽誘導(dǎo)過程中生理生化指標(biāo)變化Fig. 2 Changes of physiological and biochemical indexes during flower bud induction

2.2.2 IAA和ABA激素含量分析

花芽誘導(dǎo)過程中吲哚乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)激素含量變化見圖 3。在花芽誘導(dǎo)第 20、40、60、80天測定內(nèi)源IAA和ABA含量，綜合處理組IAA含量在40 d之前有一個緩慢下降的過程，40 d后逐漸升高，此后其含量均顯著高于對照組。而對照組IAA在誘導(dǎo)20 d時達(dá)峰值，40 d時高于處理組，40天后降至綜合處理組之下。綜合處理組在培養(yǎng)40 d時誘導(dǎo)出花芽，而對照組在40 d后也未見花芽，說明該時期之前IAA含量過高或?qū)ㄑ空T導(dǎo)有抑制作用。此后綜合處理組花芽誘導(dǎo)率與IAA含量成正比。

圖3 花芽誘導(dǎo)過程中內(nèi)源激素含量變化Fig. 3 Changes of endogenous hormone content during flower bud induction

綜合處理組花芽誘導(dǎo)過程中內(nèi)源 ABA含量變化不大，第80天的含量跟最初的含量基本持平。而對照組在第40天時達(dá)低谷值，40 d后急劇升高，60～80 d顯著高于處理組。說明穩(wěn)定的ABA含量對花芽分化具有一定的積極作用。

3 討論

蘭花開花是一個高度復(fù)雜而綜合的生物學(xué)過程，受到植株成熟度、內(nèi)源激素和營養(yǎng)物質(zhì)等因素的影響[1—2,13—14]。本研究采用一定濃度配比的 6-BA 和TDZ培養(yǎng)基，可以誘導(dǎo)試管苗形成花芽；3P/3K和3P/5K的培養(yǎng)基誘導(dǎo)花芽數(shù)量最多，且花芽均能正常發(fā)育成花苞，但未能正常開花。可見，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基合適生長調(diào)節(jié)劑濃度配比和P/K含量能有效誘導(dǎo)試管花芽，但不一定能讓花芽正常開花，花芽正常發(fā)育成花蕾并正常開花的數(shù)量非常少，這一過程中致畸率和敗育率較高，與張新平等[13]的研究結(jié)果相一致。本研究中花芽不能正常開放的原因可能與溫度有關(guān)。有研究表明，春化也是植物試管苗開花誘導(dǎo)的途徑之一。通過模擬自然界植物春化作用，能使試管苗成功開花，有效提高開花率[16—17]。通常，自然條件下春蘭的正常開花需要溫度在0～12 ℃，持續(xù)時間不少于1個月的春化過程。本研究中春蘭ב寒香梅’的花苞不能正常開放是否與春化作用有關(guān)還需進(jìn)一步驗證。

關(guān)于國蘭試管苗誘導(dǎo)開花的生理生化研究較少。本研究表明，在春蘭ב寒香梅’試管苗開花誘導(dǎo)培養(yǎng)中，試管苗的生理生化指標(biāo)隨著培養(yǎng)時間的變化發(fā)生相應(yīng)變化?；ㄑ空T導(dǎo)率高的處理較對照處理(花芽誘導(dǎo)率為 0)的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量和SOD活性整體上偏高，內(nèi)源激素IAA含量在花芽成功誘導(dǎo)出來時出現(xiàn)低谷，隨后花芽誘導(dǎo)率隨著 IAA含量上升而升高。ABA含量在0～20 d有個急劇上升，之后在花芽誘導(dǎo)的過程中緩慢下降，第80天的含量跟最初的含量基本持平，整體變化不大。進(jìn)一步說明花芽誘導(dǎo)期間蛋白質(zhì)和碳水化合物積累可促進(jìn)成花，內(nèi)源ABA含量穩(wěn)定和IAA含量增加利于成花[18—20]。

由此可見，植物生長調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)成分中P、K含量對試管花誘導(dǎo)有重要作用，不過更多研究表明，光照、春化作用等環(huán)境信號是影響多數(shù)蘭花開花啟動和發(fā)育的重要因素[21—22]，試管苗開花與之相關(guān)的研究較少。

4 結(jié)論

本研究確立了春蘭ב寒香梅’試管花誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，并通過誘導(dǎo)花芽形成過程中生理生化指標(biāo)的動態(tài)監(jiān)測，初步得出可溶性蛋白、可溶性總糖含量、SOD活性及IAA含量與花芽誘導(dǎo)率成正相關(guān)，而ABA含量維持相對穩(wěn)定對花芽分化有促進(jìn)作用。