殼聚糖鎵配合物的制備及抗菌性能研究*

付 豪，萬(wàn) 強(qiáng)，趙明源，戚曉宇，馬紅艷

(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457)

0 引 言

抗生素自問(wèn)世以來(lái)，就迅速成為對(duì)抗細(xì)菌感染的首選藥物。然而幾十年來(lái)，人們對(duì)抗生素的不合理和過(guò)度使用，使得細(xì)菌的耐藥性正在以驚人的速度增長(zhǎng)[1]。出現(xiàn)了許多多重耐藥細(xì)菌菌株(MDR)，其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(VRSA)、抗萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)和多重抗藥性結(jié)核桿菌(MDR-TB)等“超級(jí)細(xì)菌”菌株已成為目前抗菌劑的主要挑戰(zhàn)[2]。針對(duì)這一現(xiàn)狀，傳統(tǒng)的抗生素已經(jīng)不能滿足抗菌需求，研究者們將目光轉(zhuǎn)移至具有長(zhǎng)效性、廣譜抗菌性的無(wú)機(jī)抗菌劑[3]。

目前，殼聚糖(CS)作為一種天然、安全、無(wú)毒的抗菌防腐劑，在服裝、食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[4-6]。然而，殼聚糖本身抗菌能力較弱，因此提高CS的抗菌能力及抗菌持效性是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。當(dāng)前提高CS抗菌能力常用的策略之一是向CS材料中添加外源抗菌金屬添加物，如Ag、Cu、Zn、Ti以及一些金屬氧化物，以提高CS復(fù)合材料的抗菌能力[7]。金屬Ga3+由于其離子半徑，電離勢(shì)和電子親和力與Fe3+很相似，可以代替Fe3+與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成復(fù)合物并將其傳遞到細(xì)胞中[8]，但Ga3+并不能與Fe3+一樣參與氧化還原反應(yīng)[9]，這使得鎵可以通過(guò)鐵載體進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。正是鎵這種獨(dú)特的抗菌機(jī)制，使它成為潛在的有效抗菌劑，用來(lái)治療抗生素耐藥菌引起的感染[10]。

然而，單一Ga3+的抗菌活性較低，需要與載體結(jié)合來(lái)提高其抗菌活性，同時(shí)CS氨基基團(tuán)上的氮原子具有的孤對(duì)電子使得殼聚糖具有極好的金屬絡(luò)合能力。綜上，為了提高殼聚糖和Ga3+的抗菌活性，本研究用CS作為載體與Ga3+結(jié)合，獲得殼聚糖鎵配合物(CS-Ga)。這種配合物結(jié)合了殼聚糖與鎵的諸多優(yōu)點(diǎn)，殼聚糖與Ga3+發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，顯示出優(yōu)異的抗菌效果；殼聚糖又可以充當(dāng)藥物緩釋載體，為鎵類化合物在抗菌方面的應(yīng)用提供更廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥90%)，北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水氯化鎵(99.999%)阿拉丁試劑(上海)有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)，天津市匯杭化工科技有限公司；鹽酸(分析純)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇中大儀器科技有限公司)；ZF-6050型真空干燥箱(鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司)；WPL-65BE型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；YA28X-4T/10Ⅱ型高壓蒸汽滅菌鍋(寧波永興醫(yī)療器械公司)；Varion EL CUBE元素分析儀(德國(guó)元素分析系統(tǒng)公司)；Thermo iCAP65型電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖鎵復(fù)合物的制備

稱取2 g烘干后的殼聚糖粉末，溶于200 mL 0.5%的鹽酸溶液中，在60 ℃下攪拌6 h。加入6 mL 1 mol/L的氯化鎵溶液，將混合溶液在55 ℃水浴鍋中反應(yīng)24 h后取出冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至6.5，加入3倍體積無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，將沉淀反復(fù)抽濾并用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，然后置于60 ℃下真空干燥至恒重。

1.2.2 粘均分子量的測(cè)定

配制0.2 mol/L NaCl-0.1 mol/L醋酸混合溶劑。準(zhǔn)確稱取0.05 g干燥后的CS-Ga，溶解于混合溶劑中，定容至50.0 mL。粘度測(cè)定時(shí)控制水浴槽溫度在(25±0.1)℃內(nèi)，用移液管量取10.0 mL溶液至粘度計(jì)內(nèi)，恒溫20 min后測(cè)量流出時(shí)間t。用稀釋法配制不同濃度梯度的殼聚糖溶液，并測(cè)量溶液流出的時(shí)間。溶液的特性粘度ηsp=ηr-1=(t-t0)/t0，式中，t為溶液流出的時(shí)間，t0為溶劑流出時(shí)間。

根據(jù)Huggins公式ηsp/C=[η]+k[η]2C可以求出聚合物的極限粘數(shù)[η]。將ηsp/C對(duì)濃度C作圖，外推至C為0處，截距即為極限粘數(shù)[η]。再根據(jù) Mark-Houwink公式[η]=KMα可計(jì)算出粘均分子量M，對(duì)于給定的聚合物，式中K、α為常數(shù)，本實(shí)驗(yàn)條件下，采用K=1.81×10-3，α=0.93[11]。

1.2.3 元素分析

使用元素分析儀和電感耦合等離子發(fā)射光譜儀進(jìn)行分析，功率1 150 W，泵轉(zhuǎn)速50 r/min，輔助氣體流0.50 L/min，霧化器氣流0.55 L/min，冷空氣流12.00 L/min對(duì)樣品的各元素含量進(jìn)行測(cè)定；

1.2.4 掃描電子顯微鏡分析

取少量干燥24 h后的樣品粘在導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹掉導(dǎo)電膠表面粘固不牢的顆粒，然后對(duì)其進(jìn)行噴金處理，掃描電壓20 kV，用JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

1.2.5 紅外光譜表征

將制備好的樣品干燥24 h以后用瑪瑙研缽研磨成細(xì)粉，再取1 mg與干燥后的溴化鉀粉末研磨混合均勻，用小藥勺將粉末轉(zhuǎn)移至模具中壓制成片，采用布魯克品牌的TENSOR 27型號(hào)的紅外光譜儀器進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 X射線衍射分析

對(duì)制備好的樣品進(jìn)行X射線衍射檢測(cè)。測(cè)試條件為：管壓40 kV，強(qiáng)度50 mA，掃描范圍為5～60°，掃描步長(zhǎng)2θ為0.02°/step，掃描速度為1 s/step。

1.2.7 差示掃描量熱分析

對(duì)樣品進(jìn)行差示掃描量熱測(cè)定。測(cè)試方法如下：取10 mg樣品放入鋁杯并密封，以氧化鋁為對(duì)照，在氮?dú)猸h(huán)境下，以10 ℃/min的速度從40 ℃升溫到700 ℃。

1.2.8 最低抑菌濃度檢測(cè)

將大腸桿菌(E.coli)與金黃色葡萄球菌(S.aureus)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線于37 ℃下培養(yǎng)24 h后，分別挑取單一菌落接種至50 mL液體LB培養(yǎng)基中活化，再將活化后的菌液用PBS緩沖液稀釋至105CFU/mL備用。

稱取CS和CS-Ga分別加入10 mL液體LB培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)基中的藥品終濃度分別為0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22 mg/mL，對(duì)照為不加藥的空白培養(yǎng)基。將已備好的菌懸液取50 μL分別加入培養(yǎng)基中，每組相同的藥品濃度準(zhǔn)備3個(gè)平行樣品。E.coli在37 ℃培養(yǎng)24 h，S.aureus在37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液稀釋到106CFU/mL后，分別取100 μL在平板中涂布分別于37 ℃下培養(yǎng)24和48 h后，統(tǒng)計(jì)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)，得到CS和CS-Ga的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.9 不同作用時(shí)間對(duì)CS-Ga抑菌性能的影響

準(zhǔn)確稱取50.0 mg的CS和CS-Ga粉末分別倒入試管中，加入50 mL磷酸鹽緩沖液 (PBS)溶解，并超聲分散30 s后，對(duì)照為空白添加。溶解好的藥品須經(jīng)直徑0.22 μM孔徑的濾菌器過(guò)濾才可使用。取10 mL的濾液加入按1.2.8中步驟準(zhǔn)備的105CFU/mL的菌懸液50 μL，振蕩混勻10 s，分別靜置10、30、60 min，每組相同條件的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備3個(gè)平行樣品，用移液槍分別取0.5 mL混合菌懸液加入到含有4.5 mL無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液的試管中，重復(fù)操作，連續(xù)稀釋102、103、104、105倍后，用移液槍分別取3 μL的菌液滴在10 g/L的LB固體培養(yǎng)基上，倒置放在37 ℃下恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h后，觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 粘均分子量的測(cè)定

利用烏氏粘度計(jì)測(cè)量CS和CS-Ga的粘均分子量，得到兩者的比濃度與濃度的關(guān)系如圖1所示。在同一溶劑，同一溫度下，利用Huggins方程外推計(jì)算得到的[η]可以直觀地表現(xiàn)二者分子量的差距。

圖1 CS和CS-Ga的ηsp/C-C關(guān)系圖Fig 1 ηsp/C-C diagram of CS and CS-Ga

由表1可以得出，CS的粘均分子量為1.23×106，CS-Ga的粘均分子量為1.712×104，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)過(guò)程中，分子的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)被破壞變成短鏈，導(dǎo)致CS的特性粘度和粘均分子量都大大降低。

表1 CS和CS-Ga粘均分子量的測(cè)定結(jié)果

2.2 元素分析

分別對(duì)CS和CS-Ga進(jìn)行有機(jī)元素分析及ICP元素分析，其結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)表明，CS-Ga與CS的碳氮比相等且與理論值接近，說(shuō)明殼聚糖單體結(jié)構(gòu)沒有改變；樣品中鎵的含量占比達(dá)到13.30%，推測(cè)殼聚糖單體和鎵的配比約為3∶1。

表2 CS和CS-Ga中各元素的比例Table 2 The proportion of each element of CS and CS-Ga

圖2 CS(a)和CS-Ga(b)的掃描電鏡圖Fig 2 SEM of CS and CS-Ga

從圖中觀察得，CS與CS-Ga均呈分散均勻的顆粒狀物質(zhì)，CS粒徑介于20～100 μm之間，顆粒呈片狀；CS-Ga的粒徑介于10～30 μm之間，與CS相比，顆粒較小，并且分布均勻。這與2.1節(jié)結(jié)果吻合，CS-Ga的顆粒較小，粘均分子量較低。

2.3 紅外光譜分析

3 480 cm-1附近是O—H伸縮振動(dòng)造成的吸收峰，3 264 cm-1左右的吸收峰屬于N-H伸縮振動(dòng)[12]。圖1顯示在殼聚糖鎵配合物中3 300 cm-1左右的吸收峰由3 361.18 cm-1移至3 352.28 cm-1，并且峰形變得更寬，說(shuō)明鎵的加入使得N-H鍵伸縮作用減弱，N-M鍵加強(qiáng)[13]。殼聚糖中的1 659.02 cm-1為酰胺Ⅰ譜帶(C=O)、1 597.10 cm-1為酰胺Ⅱ譜帶(N-H)，而在殼聚糖鎵配合物中，酰胺Ⅱ譜帶消失，可能是殼聚糖的氨基發(fā)生了配位。1 423.96 cm-1是殼聚糖的CH2彎曲振動(dòng)和CH3變形振動(dòng)吸收峰，該峰在殼聚糖鎵配合物中變寬，吸收變?nèi)?，說(shuō)明殼聚糖的分子內(nèi)和分子間氫鍵形成方式發(fā)生變化。殼聚糖上的二級(jí)醇羥基的特征吸收峰也由1 077.50 cm-1移至1 075.11 cm-1，說(shuō)明了殼聚糖的二級(jí)醇羥基可能也參與了配位。

圖3 CS(a)和CS-Ga(b)的FT-IR曲線Fig 3 FT-IR spectra of CS and CS-Ga

2.4 結(jié)晶性分析

殼聚糖是低結(jié)晶性高分子，在研究的2θ角度范圍內(nèi)，殼聚糖的主要結(jié)晶峰在10.15°、15.3°、19.95°等處。而在CS-Ga的衍射圖中，晶體反射角出現(xiàn)在12°和26°，同時(shí)，峰形變得更寬更矮。以上結(jié)果說(shuō)明殼聚糖在結(jié)合了鎵離子之后，晶體結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，耦合效應(yīng)阻礙了分子內(nèi)氫鍵的形成，使分子內(nèi)的單元排列從有序變?yōu)闊o(wú)序，結(jié)晶度降低。

圖4 CS(a)和CS-Ga(b)的X射線衍射圖Fig 4 X-ray diffraction patterns of CS and CS-Ga

2.5 熱穩(wěn)定性分析

由圖5(a)的TG-DTG曲線可以看出，殼聚糖的熱分解分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段為25～100 ℃，樣品失重10.47%，主要原因是脫去了樣品所帶的水分；第二個(gè)階段為220～360 ℃之間，殼聚糖失重39.48%，在292.86 ℃時(shí)，殼聚糖的熱分解速率達(dá)到最大。在整個(gè)過(guò)程中，殼聚糖的總失重量為64.86%。由圖5(b)的TG-DTG曲線可以看出，殼聚糖鎵配合物的熱分解也分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段為25～160 ℃，殼聚糖鎵配合物失重9.27%，主要原因是脫去樣品所帶的水分；第二個(gè)階段為200～400 ℃，殼聚糖鎵配合物失重31.28%，在273.50 ℃時(shí)，殼聚糖鎵配合物的熱分解速率達(dá)到最大。在整個(gè)過(guò)程中，殼聚糖鎵配合物的總失重量為50.72%。與殼聚糖相比，殼聚糖鎵配合物由于結(jié)合了鎵離子，其分子內(nèi)的氫鍵結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)晶度降低，熱穩(wěn)定性減小，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]。

圖5 CS(a)和CS-Ga(b)的TG和DTG曲線Fig 5 TG-DTG curves of CS and CS-Ga

2.6 最低抑菌濃度檢測(cè)

由圖6、7可以看出，在0.1～0.22 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，三者對(duì)于E.coli與S.aureus的抗菌效果均隨著濃度的增大而增加。其中，在此濃度范圍內(nèi)，氯化鎵對(duì)E.coli與S.aureus的抗菌效果均不太顯著，殼聚糖鎵金屬配合物的抗菌效果最為明顯。對(duì)于E.coli，殼聚糖鎵配合物的最低抑菌濃度為0.18 mg/mL，低于殼聚糖的最低抑菌濃度0.22 mg/mL；對(duì)于S.aureus，殼聚糖鎵配合物的最低抑菌濃度為0.16 mg/mL，低于殼聚糖的最低抑菌濃度0.18 mg/mL。以上結(jié)果表明，殼聚糖在結(jié)合了鎵離子之后，抗菌活性得到了提升，這個(gè)結(jié)果與多個(gè)文獻(xiàn)所報(bào)道的殼聚糖金屬配合物的抗菌性高于殼聚糖的抗菌結(jié)果一致[15-18]。

圖6 不同濃度的CS，GaCl3和CS-Ga對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig 6 Antibacterial effect of different concentrations of CS, GaCl3 and CS-Ga on E. coli

圖7 不同濃度的CS，GaCl3和CS-Ga對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig 7 Antibacterial effect of different concentrations of CS, GaCl3 and CS-Ga on S. aureus

2.7 不同作用時(shí)間對(duì)CS-Ga抑菌性能的影響

由于CS-Ga對(duì)E.coli的抗菌性與殼聚糖的差異不大，所以研究了CS和CS-Ga分別與S.aureus接觸不同時(shí)間后對(duì)其活性的影響。圖8(D～F)是殼聚糖與S.aureus混合培養(yǎng)10、30、60 min后，在胰蛋白酶瓊脂板接種培養(yǎng)后的數(shù)碼照片; 圖8(G～I(xiàn))是殼聚糖鎵配合物與S.aureus混合培養(yǎng)10、30、60 min后，在胰蛋白酶瓊脂板接種培養(yǎng)后的數(shù)碼照片；圖8(A～C)為空白對(duì)照。培養(yǎng)皿上的1、2、3、4分別代表不同的稀釋倍數(shù)下接種細(xì)菌生長(zhǎng)情況。殼聚糖由于其分子鏈上有氨基的存在，具有一定的抑菌殺菌性能。在結(jié)合了鎵離子后，鎵離子可以進(jìn)入細(xì)胞從而影響細(xì)菌的鐵代謝途徑，抑制細(xì)菌正常的代謝活動(dòng)。殼聚糖與鎵離子發(fā)揮協(xié)同抗菌的作用，使得殼聚糖鎵配合物的抗菌性提高。CS-Ga與細(xì)菌作用10 min時(shí)，便發(fā)揮了作用，作用60 min后，CS-Ga便可完全抑制S.aureus的生長(zhǎng)。圖8中菌落生長(zhǎng)情況很直觀地顯示了CS-Ga對(duì)S.aureus具有優(yōu)異的抗菌性。

注：A～C：與對(duì)照混合10、30、60 min后；D～F：與CS混合10、30、60 min后；G～I(xiàn)：與CS-Ga混合10、30、60 min后圖8 金黃色葡萄球菌的菌落生長(zhǎng)狀況Fig 8 Colony growth status of S. aureus

3 結(jié) 論

成功制備了殼聚糖鎵配合物，通過(guò)粘度法、有機(jī)元素分析、ICP、SEM、FT-IR、XRD對(duì)其進(jìn)行了表征，利用熱重測(cè)試了其熱穩(wěn)定性，并對(duì)殼聚糖鎵配合物的抗菌性能進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。

(1)殼聚糖與鎵的結(jié)合導(dǎo)致分子內(nèi)氫鍵結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使得殼聚糖鎵配合物結(jié)晶度降低，結(jié)晶度的降低有利于配合物藥物的擴(kuò)散和吸收，直接增強(qiáng)了其分散性和間接增強(qiáng)其抗菌性能。

(2)與殼聚糖相比，殼聚糖鎵配合物粒徑明顯減小，熱穩(wěn)定性有所降低。在與鎵結(jié)合的過(guò)程中，殼聚糖分子中的羥基、氨基、乙酰氨基參與了配位，合成的殼聚糖鎵配合物中，鎵的含量為13.3%，同時(shí)依據(jù)鎵在此配合物中以三價(jià)形式存在，由此推測(cè)殼聚糖單體與鎵的配比約為3∶1。

(3)體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，殼聚糖鎵配合物對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.18和0.16 mg/mL，濃度為1.0 mg/mL的殼聚糖鎵配合物在與細(xì)菌混合培養(yǎng)僅60 min后，即可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。