磷霉素與其他抗菌藥物對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)研究

劉云寧，李小鳳，湯建華，張鶴鳴，劉金祿，劉曉明

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1. 藥學(xué)部； 2. 微生物科，河北 張家口 075000)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是醫(yī)院感染常見(jiàn)的條件致病菌，當(dāng)人體接受侵襲性操作、免疫力下降、具有慢性結(jié)構(gòu)性肺病、長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗菌藥物等情況時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致感染[1]。2014—2019年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[2]顯示，PA對(duì)亞胺培南的耐藥率為18.2%～21.0%。 PA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括主動(dòng)外排泵作用，產(chǎn)生抗生素水解酶和修飾酶，改變菌體細(xì)胞膜通透性以及染色體突變或捕獲外源性基因盒獲得耐藥性等[3]，在常用抗菌藥物中極易產(chǎn)生交叉耐藥，并呈現(xiàn)多重耐藥(multidrug resistance, MDR)或泛耐藥(extensive drug resistance, XDR)的特征，增加臨床治療難度[4]。磷霉素(fosfomycin, FOS)是磷酸烯醇丙酮酸的類似物，對(duì)耐藥的革蘭陽(yáng)性(G+)菌和革蘭陰性(G-)菌均具有良好的抗菌活性，作用機(jī)制獨(dú)特且與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥[5]。研究以FOS為主，聯(lián)合其他抗菌藥物對(duì)PA的體外藥敏試驗(yàn)，以期為臨床治療多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)感染提供合理的給藥方案。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2018年1月—2019年12月某三甲醫(yī)院50例不同住院患者標(biāo)本無(wú)重復(fù)分離的50株(痰40株，分泌物7株，血3株)受試PA。菌株的分離、培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版進(jìn)行。全部菌株均采用BD Phoenix 100全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析儀鑒定，對(duì)于常見(jiàn)抗菌藥物(包括頭孢菌素類、碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類)中3類或3類以上的藥物耐藥，符合MDR-PA標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.2 藥品與儀器 FOS購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，葡萄糖-6-磷酸鹽購(gòu)自上海浦津生物科技有限公司，哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、美羅培南(MEM)、阿米卡星(AMK)、環(huán)丙沙星(CIP)藥敏紙片均購(gòu)自O(shè)XOID公司，BD-Phoenix 100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。

1.3 試驗(yàn)方法 采用瓊脂平板稀釋法結(jié)合紙片擴(kuò)散法，測(cè)定聯(lián)合藥物對(duì)PA的敏感性。嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第四版)制備瓊脂培養(yǎng)液(培養(yǎng)液含25 mg/L葡萄糖-6-磷酸鹽)，在瓊脂培養(yǎng)液中加入 FOS，制成含不同濃度 FOS的瓊脂培養(yǎng)皿(50、100、150、200、250 μg/mL)。將同一株P(guān)A菌株接種到含不同濃度 FOS的瓊脂培養(yǎng)皿中，并將聯(lián)用抗菌藥物的藥敏紙片粘貼于培養(yǎng)皿上，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，由同一檢驗(yàn)師用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用WHONET 5.6軟件、SPSS 22.0軟件進(jìn)行耐藥資料分析。相同藥物與不同濃度FOS的組合，對(duì)PA的敏感性變化采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的多組秩和檢驗(yàn)(Kruskal-WallisH)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性 試驗(yàn)篩選的50株MDR-PA均通過(guò)BD Phoenix 100全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析儀進(jìn)行復(fù)核，對(duì)TZP 2株中介，CAZ 2株中介，MEM 8株中介，AMK 6株中介，CIP 3株中介；對(duì)哌拉西林、氨曲南、頭孢吡肟、左氧氟沙星均表現(xiàn)為耐藥；多粘菌素對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC≤1 μg/mL；此外2株試驗(yàn)菌株對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為中介。

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果 FOS 200 μg/mL組，TZP+FOS組敏感2株，中介5株，耐藥43株，敏感率4.0%；CAZ+FOS組敏感6株，中介6株，耐藥38株，敏感率12.0%；MEM+FOS組敏感30株，中介8株，耐藥12株，敏感率60.0%；FOS+AMK組敏感7株，中介16株，耐藥27株，敏感率14.0%；FOS+CIP組敏感29株，中介11株，耐藥10株，敏感率58.0%。

分析FOS不同濃度含藥平板分別聯(lián)合5種抗菌藥物的藥敏結(jié)果，結(jié)果顯示：FOS+TZP、FOS+CAZ在不同F(xiàn)OS濃度(50～250 μg/mL)組間均無(wú)協(xié)同作用(P>0.05)；FOS+MEM、FOS+AMK、FOS+CIP在不同磷霉素濃度(50～250 mg/L)組間均表現(xiàn)出協(xié)同作用(P<0.05)。FOS+MEM、FOS+CIP、FOS+AMK組合兩兩比較，F(xiàn)OS+MEM組合與FOS+CIP組合在所有劑量組中比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；在低劑量組(50、100 μg/mL)，F(xiàn)OS+AMK與FOS+MEM、FOS+CIP比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；在高劑量組(150、200 μg/mL)，F(xiàn)OS+AMK與FOS+MEM比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.032 5，P=0.003；χ2=9.4578，P=0.002)；在高劑量組(150、200 μg/mL)，F(xiàn)OS+AMK與FOS+CIP比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.6768，P=0.001；χ2=12.3981，P<0.001)。FOS+MEM組合、FOS+CIP組合比FOS+AMK組合更敏感。見(jiàn)表1。

表1 50株MDR-PA體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

FOS是小分子親水性抗菌藥物，血漿蛋白結(jié)合率極低(2.16%)，靜脈給藥后幾乎完全通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)消除(95%～99%)。靜脈滴注 FOS 0.5、1.0、2.0、4.0 g后血藥峰濃度分別為28、46、90、195 μg/mL。蒙特卡洛模擬顯示，對(duì)于重癥感染患者延長(zhǎng)輸注法(6g/q6h)可提高 Cmax并縮短 Tmax，且與其他抗菌藥物有很好的協(xié)同作用[6]。 FOS持續(xù)輸注(負(fù)荷劑量8 g，之后1 g/h)給藥方案，其穩(wěn)態(tài)濃度為(183.8±35.9)μg/mL[7]。Walsh等[8]體外研究顯示， FOS可中等程度殺滅低接種量(最大殺滅3 log10 CFU/mL)的PA，但24 h后PA會(huì)再次生長(zhǎng)，此時(shí)敏感菌株完全由耐藥株取代，該研究結(jié)果與Rodríguez-Gascón等[9]的研究均提示, FOS不宜單藥治療PA感染。

PA的耐藥機(jī)制復(fù)雜多變，其中生物被膜的形成可以使PA逃避機(jī)體免疫和抗菌藥物的殺傷作用。Wang等[10]研究顯示，F(xiàn)OS+CIP聯(lián)合用藥對(duì)PA生物膜清除的協(xié)同作用為57.1%。Yamada等[11]通過(guò)電子顯微鏡觀察到，與單獨(dú)用藥相比， FOS聯(lián)合CIP更易導(dǎo)致細(xì)胞膜溶解。Gómez-Garcés等[12]體外抗菌試驗(yàn)顯示， FOS聯(lián)合CIP對(duì)40%的CRPA具有協(xié)同作用，未見(jiàn)拮抗作用。

一項(xiàng)關(guān)于FOS+AMK聯(lián)合吸入系統(tǒng)(AFIS)的研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥(AMK∶FOS為 5∶2)聯(lián)合劑對(duì)PA的最低抑菌濃度(MIC)值較AMK和FOS單藥的MIC值降低一半[13]。Sime等[14]研究呼吸機(jī)相關(guān)肺炎患者臨床分離菌株發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS單藥對(duì)PA無(wú)任何抗菌活性，AMK 24 h內(nèi)可產(chǎn)生較好的抗菌活性，但隨后可快速產(chǎn)生耐藥性，但二者聯(lián)合用藥可產(chǎn)生快速殺菌作用，同時(shí)有效抑制耐藥菌株的產(chǎn)生。CRPA體外抗菌活性試驗(yàn)顯示，F(xiàn)OS與AMK的協(xié)同殺菌率為12%[12]，無(wú)拮抗作用。

FOS聯(lián)合碳青霉烯類抗生素可降低PA生物膜的形成，并降低其自發(fā)突變率。FOS聯(lián)合MEM對(duì)PA的協(xié)同殺菌率為53.3%(8/15)[15]，對(duì)CRPA的協(xié)同殺菌率40.0%(28/70)[16]，且均未發(fā)現(xiàn)拮抗作用。Albiero等[17]對(duì)產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)的PA進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)FOS聯(lián)合MEM使得PA的MIC50和MIC90降低至1/8。Drusano等[18]研究顯示，不同給藥劑量的FOS聯(lián)合MEM方案，均能夠降低選擇耐藥性的出現(xiàn)(MEM突變體被聯(lián)合殺傷，以及FOS突變體被聯(lián)合殺傷)，研究結(jié)果表明，聯(lián)合給藥方案對(duì)于殺滅細(xì)菌細(xì)胞和抑制耐藥菌株的出現(xiàn)均具有明顯的協(xié)同作用。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OS+MEM、FOS+AMK、FOS+CIP組合在FOS各劑量組合比較中均有差異(P<0.05)，敏感性增加，但在兩兩比較中FOS+MEM組合和FOS+CIP組合與FOS+AMK組合在FOS高劑量組(150、200 μg/mL)中均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示FOS+MEM組合和FOS+CIP組合對(duì)MDR-PA表現(xiàn)出較高的抗菌活性。結(jié)合FOS的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)提示，F(xiàn)OS聯(lián)合治療MDR-PA感染時(shí)應(yīng)給予較高的劑量。

FOS與TZP、CAZ聯(lián)合用藥方案的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少，Tessier等[19]研究顯示，F(xiàn)OS與CAZ聯(lián)合用藥僅有20%的相加作用，80%無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OS+TZP組合與FOS+CAZ組合在FOS各劑量組合比較中，差異均無(wú)意義(均P>0.05)，敏感性無(wú)明顯增加，與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，因此不推薦臨床聯(lián)合給藥。

MDR-PA的治療藥物選擇非常有限。本研究為FOS聯(lián)合其他藥物治療MDR-PA提供了理論依據(jù)，但本研究數(shù)據(jù)較為有限，且研究結(jié)果僅顯示藥物體外敏感情況，聯(lián)合用藥的臨床療效有待進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)，同時(shí)本研究中FOS發(fā)揮抗菌活性時(shí)給藥劑量相對(duì)較高，臨床應(yīng)用過(guò)程中需要警惕FOS引起的靜脈炎、高鈉血癥等不良反應(yīng)。