土壤中抗生素類物質(zhì)的分析研究進(jìn)展

呂振娥

(烏魯木齊市米東區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，新疆 烏魯木齊 830000)

1 抗生素污染及監(jiān)測(cè)研究現(xiàn)狀

1.1 醫(yī)藥品和個(gè)人護(hù)理品引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題

一般來(lái)說(shuō)，日常生活中經(jīng)常使用的化學(xué)產(chǎn)品如醫(yī)藥品、化妝品等統(tǒng)稱為“醫(yī)藥品和個(gè)人護(hù)理品”，即PPCPs。對(duì)于醫(yī)藥品，目前大約有4500種被廣泛使用，而個(gè)人護(hù)理品的全球年生產(chǎn)量也已超過(guò)106t，因此PPCPs成為了一類“新型”化學(xué)物質(zhì)，且呈現(xiàn)出一種持續(xù)存在的狀態(tài)，被科學(xué)家們稱為“虛擬持久性化學(xué)物質(zhì)”[1]。

PPCPs被源源不斷地輸入環(huán)境，導(dǎo)致其在環(huán)境中的殘留量不斷增大，最終可能危害到人類的生產(chǎn)生活以及生態(tài)環(huán)境安全。但目前人類對(duì)其認(rèn)識(shí)還非常有限，因此有必要對(duì)其存在現(xiàn)狀進(jìn)行更廣泛和深入的研究。由于PPCPs自身存在種類繁多、半衰期短和濃度低等特點(diǎn)，使建立同等條件下高靈敏、高特異性的多種污染物類別的同時(shí)檢測(cè)分析方法成為PPCPs研究領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵。

1.2 環(huán)境中抗生素的來(lái)源及負(fù)面效應(yīng)

1.2.1 環(huán)境中抗生素的來(lái)源

抗生素屬于眾多的PPCPs類物質(zhì)中使用較為廣泛的醫(yī)藥品類，其能引起抗藥病原菌的選擇性存活，目前已受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。1940年以來(lái)，抗生素被大范圍使用，主要用于預(yù)防和治療疾病或者促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。臨床常用的類別主要包括四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和磺胺類等。

目前，全球每年使用的各種抗生素總量已超過(guò)20萬(wàn)t[2]。1999年，歐盟和瑞士用于人體健康和動(dòng)物疾病、生長(zhǎng)促進(jìn)作用的抗生素用量分別達(dá)到8637.2t和3853.5t[3]。統(tǒng)計(jì)顯示，美國(guó)從1995—2002年，喹諾酮類和磺胺類抗生素位于前200種最經(jīng)常用的處方藥之中，而我國(guó)在2003年，青霉素和土霉素的生產(chǎn)量占到了世界總產(chǎn)量的60%和65%[1]。在我國(guó)醫(yī)院使用量與銷售量排名中，前15名藥物中有10種均為抗生素。因此，過(guò)度使用抗生素的現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍。

抗生素經(jīng)人體或動(dòng)物攝入后，85%以原形或代謝產(chǎn)物的形式排放進(jìn)入環(huán)境[3]。由于絕大多數(shù)的抗生素具有極性高的特點(diǎn)，因此水環(huán)境中的抗生素普遍存在。在污水處理過(guò)程中，一些抗生素類物質(zhì)無(wú)法被有效去除，從而排入天然水體；人類丟棄或者動(dòng)物等攝入后排出的抗生素可能通過(guò)施肥等各種途徑進(jìn)入土壤；通過(guò)水循環(huán)，地表水體、土壤等介質(zhì)中的抗生素可能污染到飲用水；另外，企業(yè)廢水特別是制藥廠、養(yǎng)殖業(yè)廢水的無(wú)監(jiān)管亂排現(xiàn)象也是不容忽視的。目前在水體、食品、沉積物、動(dòng)物糞便以及土壤中都廣泛地檢出了抗生素殘留[3]。

1.2.2 抗生素的危害

抗生素的過(guò)度使用會(huì)增強(qiáng)一些細(xì)菌等微生物的耐藥性，而隨著耐藥微生物的不斷增多，其最終將成為環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌并不斷繁殖，即使環(huán)境中的抗生素污染可以消除，已經(jīng)形成的耐藥微生物仍然會(huì)在環(huán)境中持續(xù)存在，從而威脅到人類的生存環(huán)境。

目前，四環(huán)素、磺胺、β-內(nèi)酰胺等抗生素的耐性微生物已經(jīng)廣泛出現(xiàn)于污灌土壤、污水處理廠出水、河道沉積物，甚至飲用水中，且在新研制的抗生素中也存在這種情況，如喹諾酮類抗生素[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2001年美國(guó)醫(yī)院50%～60%的感染均源于耐藥菌。在1994—2008年，荷蘭土壤中抗生素耐藥基因的水平最高達(dá)到20世紀(jì)70年代的15倍[5]。同時(shí)，耐藥微生物不僅表現(xiàn)為對(duì)某一種抗生素產(chǎn)生耐藥性，某些菌株甚至可以同時(shí)對(duì)100多種抗生素產(chǎn)生耐性。此外，耐藥基因還可以發(fā)生重組、水平轉(zhuǎn)移，繼而在環(huán)境中傳播[5]。

除耐藥性外，環(huán)境中低濃度抗生素的持續(xù)存在還會(huì)對(duì)水生生物、植物、動(dòng)物產(chǎn)生遺傳毒性、慢性毒性和致癌性等生態(tài)毒性，并影響環(huán)境中各種微生物的數(shù)量和種類結(jié)構(gòu)，從而破壞原本和諧的生物之間的聯(lián)系和平衡。雖然目前抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)均是基于有限的監(jiān)測(cè)和對(duì)生物的毒理數(shù)據(jù)，但已經(jīng)初步表明其對(duì)生物圈具有一定的危害。

1.3 環(huán)境中抗生素類物質(zhì)的監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀

1.3.1 抗生素的儀器分析方法

抗生素的殘留分析最早于20世紀(jì)90年代開(kāi)始，氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)是當(dāng)時(shí)最主要的分析手段。由于大多數(shù)藥物具有不易揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此使用GC/MS檢測(cè)環(huán)境中的抗生素存在一定的限制因素。

近年來(lái)，對(duì)于多組分抗生素殘留的分析多采用高效液相色譜(HPLC)，而檢測(cè)器除了紫外、熒光時(shí)有應(yīng)用，質(zhì)譜尤其是串聯(lián)質(zhì)譜由于具有較高選擇性和靈敏性已成為主流的定性和定量手段[6]。在質(zhì)譜的使用過(guò)程中，離子源的選擇是很重要的。大氣壓化學(xué)電離(APCI)基質(zhì)效應(yīng)小，但實(shí)際環(huán)境中的抗生素殘留濃度往往是痕量，因此偏低的靈敏度使其在檢測(cè)中受到一定限制。而ESI源雖然受基質(zhì)影響較大，基質(zhì)干擾會(huì)減少離子化效率，使基線升高，方法靈敏度降低，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤，但由于其對(duì)極性、弱極性及熱不穩(wěn)定性物質(zhì)良好的適用性，成為了抗生素分析中最頻繁使用的離子化方式。因此，LC-MS/MS分析中一個(gè)典型的問(wèn)題就是基質(zhì)效應(yīng)。在提取或富集濃縮目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，往往會(huì)共存大量的雜質(zhì)，而且這種抑制作用不但在復(fù)雜介質(zhì)如土壤和沉積物中存在，甚至分析飲用水中也存在(四環(huán)素、磺胺、喹諾酮)。

對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)，目前部分研究者通過(guò)使用內(nèi)標(biāo)法定量、同位素標(biāo)記以及減少進(jìn)樣量的方法以使結(jié)果更可靠，但內(nèi)標(biāo)法太耗時(shí)，同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)太昂貴且不易購(gòu)買，因此大部分研究者并未提及此類問(wèn)題，也尚未有明確的解決方案。近年來(lái)四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF)逐漸被用于藥品的環(huán)境分析中，其可以同時(shí)對(duì)近百種藥物進(jìn)行檢測(cè)，具有更佳的定性能力。隨著人們對(duì)環(huán)境分析的準(zhǔn)確度的不斷提高，開(kāi)發(fā)更加靈敏的不同種類多組分殘留分析技術(shù)已成為抗生素環(huán)境分析領(lǐng)域的必然趨勢(shì)。

1.3.2 環(huán)境中抗生素樣品制備方法

樣品制備的主要目的是分離出非目標(biāo)物質(zhì)，使目標(biāo)物質(zhì)的純度和濃度得到提高，為后續(xù)的儀器分析做好準(zhǔn)備，因此樣品的物化性質(zhì)以及基質(zhì)性質(zhì)就成為了樣品前處理的重要影響因素。樣品制備過(guò)程包括酸堿度的調(diào)整、萃取過(guò)程中加入螯合劑、對(duì)萃取液進(jìn)行處理以及為色譜分析進(jìn)行的準(zhǔn)備工作等。

有文獻(xiàn)報(bào)道，四環(huán)素類(TCs)和氟喹諾酮類(FQs)抗生素可與環(huán)境中的二價(jià)金屬離子形成復(fù)雜螯合物，從而不可逆地吸附在固相萃取柱上或者黏附在玻璃器皿上。因此，需要向環(huán)境樣品中加入螯合劑，如乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、草酸或檸檬酸，以去除干擾、改善峰形，其中Na2EDTA是最常用的手段。此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用稀硝酸浸泡玻璃器皿也是改善回收率的方法之一。

對(duì)于環(huán)境中抗生素的富積凈化，固相萃取(SPE)因具有速度快、穩(wěn)定性好、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而成為主流方法。在固相萃取柱的選擇上，有文獻(xiàn)研究[7]將親水親油平衡HLB柱、強(qiáng)陽(yáng)離子交換MCX柱和C18柱進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn),MCX柱對(duì)酸性物質(zhì)具有較好保留效果，但對(duì)于堿性和中性化合物，回收率則偏低，因此為了高效率地萃取堿性物質(zhì)，樣品的pH值必須調(diào)低；C18柱對(duì)于大多數(shù)物質(zhì)都是適用的，但含有自由硅醇基團(tuán)，會(huì)與四環(huán)素類抗生素發(fā)生不可逆的結(jié)合，從而降低富集效率。Lindsey等通過(guò)比較4種固相萃取柱(500mg C18、150mg ENV+、60mg HLB、500mg HLB)分析水體中6種磺胺和5種四環(huán)素的富積效果，結(jié)果顯示，四環(huán)素類不能從C18和ENV+柱上洗脫下來(lái)。因此，HLB柱(由親脂烷酮的二乙烯基苯和親水的N-乙烯基吡咯烷酮2種單體按比例聚合而成)較其它萃取柱具有更高的萃取效率，pH(1～14)范圍也更廣，適用于所有物質(zhì)，美國(guó)EPA對(duì)74種醫(yī)藥品的富集均是采用的HLB柱。但是，HLB柱會(huì)富集大量的雜質(zhì)，近年來(lái)部分研究者采用串聯(lián)SPE柱，如C18-HLB、SAX-HLB等，通過(guò)串聯(lián)柱的進(jìn)一步凈化成為了降低基質(zhì)效應(yīng)的方法之一。

固體樣品中抗生素的前處理較水體中的多一個(gè)提取步驟，目前提取方法有微波輔助(MAE)、加壓溶劑萃取(PLE)、震蕩-超聲、加速溶劑萃取(ASE)等，其中最常用的是超聲-震蕩-離心和ASE 2種提取方法。在提取液的選擇方面，通常采用緩沖液如磷酸、McIlvaine(檸檬酸與磷酸鹽混合液，pH 4～6)、檸檬酸等與一定比例的有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等混合。如，EPA關(guān)于固體介質(zhì)中醫(yī)藥品提取的標(biāo)準(zhǔn)方法是選用磷酸鹽緩沖液(pH=2)和乙腈，回收率在20%～260%。固體樣品提取液經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的固相萃取富集后再進(jìn)行測(cè)定，HLB柱仍然是最常使用的固相萃取柱。馬麗麗等[7]對(duì)比了ProElut C18、HyperSep Retain PEP、HyperSep C18和Oasis HLB 4種反相萃取柱對(duì)土壤中四環(huán)素、磺胺和喹諾酮的富集效果，結(jié)果表明，以聚合物為填料的HyperSep Retain PEP柱和Oasis HLB明顯較硅膠鍵合的C18柱所得到的回收率高，而同時(shí)提取這3類抗生素時(shí)，Oasis HLB的效果最好。但目前固體介質(zhì)中分析的物質(zhì)和手段還很有限，提取效率和基質(zhì)效應(yīng)是一個(gè)重要的制約因素。

1.4 環(huán)境中抗生素殘留研究進(jìn)展

目前，關(guān)于城市污水處理廠[8]進(jìn)出水中抗生素殘留情況的報(bào)道層出不窮，范圍涵蓋了歐洲、北美、非洲和亞洲部分國(guó)家，其中最頻繁報(bào)道的幾種抗生素類物質(zhì)主要是SMX(20～870ng·L-1)、TMP(7～1340ng·L-1)、CIP(20～600ng·L-1)、OFL(20～600ng·L-1)、NOR(30～120ng·L-1)和ERY(15～2054ng·L-1)。且關(guān)于地表水體中抗生素的濃度水平在美國(guó)、德國(guó)、英國(guó)和巴西等已經(jīng)廣泛報(bào)道。Kolpin等較全面地分析了美國(guó)30個(gè)州內(nèi)139多條河流水中農(nóng)藥、醫(yī)藥、獸藥、激素等95種有機(jī)污染物，其中抗生素濃度均在μg·L-1級(jí)[9]。而在我國(guó)珠江、香港和海河流域中抗生素的濃度在3～410ng·L-1。飲用水作為直接暴露途徑，與人們的健康息息相關(guān)，USGS在2000年和2001年對(duì)本國(guó)飲用水源的普查時(shí)檢出了SMX、TMP、SMA、ERY、CIP等抗生素類物質(zhì)，濃度水平最高已達(dá)到1110ng·L-1[10]。

已有的研究表明，不同種類抗生素在土壤環(huán)境中的濃度范圍在0.1～2683.0μg·kg-1，其中土霉素在土壤中的殘留量最大。加拿大土壤環(huán)境中四環(huán)素濃度可達(dá)到52μg·kg-1，我國(guó)北方土壤中四環(huán)素和金霉素的殘留濃度分別為20.9～105.0μg·kg-1，33.1～1079.0μg·kg-1[11,12]。西班牙農(nóng)田土壤中磺胺類抗生素的平均濃度為0～50.53ng·g-1[13]，美國(guó)施用糞肥土壤中檢測(cè)到磺胺甲惡唑的濃度為34.5～663ng·kg-1[14]。氟喹諾酮在土壤中的殘留濃度范圍在μg·kg-1～mg·kg-1，東莞蔬菜地4種喹諾酮的檢出率均為90%以上，總含量為0～554.1μg·kg-1，瑞士施用城市污泥土壤中諾氟沙星和環(huán)丙沙星含量分別為0.27～0.4mg·kg-1和0.27～0.32mg·kg-1[15]。目前的研究中，施肥后土壤中檢測(cè)到四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的最大濃度依次為0.3mg·kg-1、0.015mg·kg-1和0.37mg·kg-1[17]。由此可見(jiàn)，不同地域、不同類型土壤中抗生素的含量差異較大。

2 抗生素污染及監(jiān)測(cè)研究現(xiàn)狀小結(jié)

抗生素作為PPCPs的一大類，已經(jīng)被研究了10a多，尤其是水環(huán)境中的抗生素環(huán)境污染得到了廣泛的關(guān)注，但關(guān)注的物質(zhì)仍十分有限。而有關(guān)固體介質(zhì)如土壤中抗生素的殘留情況的報(bào)道還相對(duì)較少，此外，關(guān)于其進(jìn)入環(huán)境的代謝產(chǎn)物的研究還十分匱乏。由于土壤環(huán)境相對(duì)較復(fù)雜，分析方法的有限性可能是限制當(dāng)前土壤中抗生素環(huán)境研究的一個(gè)重要原因。這種限制性著重體現(xiàn)在樣品的有效前處理和分析的靈敏度上，這類物質(zhì)在環(huán)境中普遍濃度低，且極易受到基質(zhì)干擾。因此，需要建立一種可以同時(shí)檢測(cè)多種抗生素物質(zhì)包括其代謝產(chǎn)物在內(nèi)的分析方法，檢測(cè)盡量多的物質(zhì)，從而系統(tǒng)全面地探析這類物質(zhì)的環(huán)境污染特征，為研究其風(fēng)險(xiǎn)及以環(huán)境管理策略提供依據(jù)。特別是作為一個(gè)抗生素的生產(chǎn)和使用大國(guó)，我國(guó)環(huán)境中抗生素的種類、濃度水平和環(huán)境影響可能和別國(guó)有所不同。