胚胎植入前遺傳學檢測降低高齡凍融胚胎移植患者早期自然流產(chǎn)率的研究

邢 俊，王 潔，黃晨陽，周建軍

1南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，江蘇 南京 210008；2南京大學分子生殖醫(yī)學中心，江蘇 南京 210008

1 對象和方法

1.1 對象

收集2015年4月1日—2020年7月30日南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行激素替代周期FET的1 598個單囊胚FET周期，其中常規(guī)FET周期1 495個，行PGT 助孕的PGT?FET 共103 個周期。103 個PGT?FET 周期中56 個周期為PGT?A，33 個周期為胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)重排檢測（preimplanta?tion genetic testing for structural rearrangements，PGT?SR），14 個周期為胚胎植入前單基因病遺傳學檢測（preimplantation genetic testing for monogenic dis?ease，PGT?M），均采用二代測序法進行全染色體拷貝數(shù)變異（copy number variant，CNV）分析，以篩選整倍體囊胚進行移植。排除了非高齡（＜35歲）、生殖道畸形、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥患者。所有患者簽署知情同意書，其中進入臨床PGT周期的患者均額外簽署了PGT知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方案

本中心采用常規(guī)的控制性促排卵方案，監(jiān)測患者外周血清性激素變化情況，同時陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當有2 個卵泡直徑≥18 mm 時，注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）5 000～10 000 U，36 h后行陰道超聲介導(dǎo)取卵。

1.2.2 體外受精、胚胎培養(yǎng)和囊胚活檢

取卵術(shù)中取出的成熟MⅡ卵母細胞行卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），ICSI 術(shù)后16～18 h 進行原核觀察，以受精卵出現(xiàn)雙原核即2PN 為正常受精。在ICSI 注射后第3 天，使用激光在卵裂期胚胎透明帶切1 個10 μm 的孔徑。囊胚的評分由2位高年資胚胎學家依據(jù)Gardner囊胚評分標準進行評估［7-8］。使用5期和6期囊胚用于活檢，用內(nèi)徑20 μm的活檢針從孵出的囊胚滋養(yǎng)層中吸取5～10個細胞后，采用激光輔助切割。取下的細胞用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，轉(zhuǎn)移至0.2 mL PCR管于-80 ℃冰箱儲存?；顧z后的囊胚立即進行玻璃化冷凍，儲存于液氮中。

未行PGT檢測的患者，在授精后第3天，選擇2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進行冷凍。剩余胚胎的細胞數(shù)≥4 個且未發(fā)育停滯，在原核期未觀察到多核現(xiàn)象，則繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)，依據(jù)Gardner 囊胚評分標準，4 期、5 期和6 期囊胚為可冷凍的囊胚。

1.2.3 全基因組擴增和基于二代測序的染色體CNV分析

活檢取出的滋養(yǎng)層細胞采用REPLI?g單細胞擴增試劑盒（Qiagen 公司，德國）或用Sureplex 單細胞擴增試劑盒（Illumina 公司，美國）進行全基因組擴增，構(gòu)建DNA 文庫，采用MiSeq 測序儀（Illumina 公司，美國）進行DNA 高通量測序［9-10］，檢測范圍涵蓋23 對染色體，能檢測到4 Mb 以上片段微缺失/微重復(fù)。篩選出正常的、可移植的胚胎，擇期行胚胎移植。

1.2.4 子宮內(nèi)膜的準備、胚胎移植

茶樹的生長與特定的地質(zhì)背景關(guān)系密切，影響茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的主要條件有：地形地貌、植被類型、母質(zhì)、地球化學背景等。通過楊頭村與雙溪村茶園種植條件的對比研究，基本摸清了優(yōu)勢茶園和劣勢茶園的劃分標準。

入組患者均采用激素替代周期方案進行內(nèi)膜準備，服藥14～20 d，根據(jù)患者內(nèi)膜情況及性激素水平肌肉注射黃體酮注射液（浙江仙琚制藥）60 mg/d進行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化6 d 后安排解凍囊胚移植。移植后14 d 檢測血清hCG，hCG＞200 mU/mL 為生化妊娠，移植后28～30 d經(jīng)陰道超聲檢查見妊娠囊者為臨床妊娠。妊娠12周前發(fā)生的自然流產(chǎn)定義為早期自然流產(chǎn)，其余孕周＜28周或胎兒體重＜1 000 g的流產(chǎn)為晚期流產(chǎn)。按期隨訪至胎兒出生，記錄胎兒出生數(shù)量及情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用Kolmogo?rov?Smirnov test 對各組數(shù)據(jù)的進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布則用Mann?WhitneyU檢驗進行連續(xù)變量數(shù)據(jù)的兩組間比較。分類變量數(shù)據(jù)則采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。PSM過程設(shè)定卡鉗值為0.05，對患者基礎(chǔ)特征（女方年齡、轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度＜8 mm或≥8 mm、移植第5 天或第6 天囊胚）3 個因素采用1∶2 隨機匹配法進行匹配。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PGT?FET 周期與常規(guī)FET 周期的人群特征及臨床結(jié)局比較

比較PGT?FET 組103 個周期和常規(guī)FET 組的1 495個周期的人群特征及臨床結(jié)局。結(jié)果顯示，兩組間的女方年齡、男方年齡等基線資料差異無統(tǒng)計學意義，周期數(shù)據(jù)提示兩組移植前子宮內(nèi)膜厚度無顯著差異。但PGT?FET組與常規(guī)FET組第5天囊胚（D5）占總體移植胚胎（D5+D6）的比例差異有統(tǒng)計學意義。在此基礎(chǔ)上，分析兩組FET 后的臨床妊娠結(jié)局。結(jié)果顯示，PGT?FET 組患者早期自然流產(chǎn)率顯著低于常規(guī)FET 組（11.11%vs.25.31%，P＜0.05），PGT?FET 組活產(chǎn)率顯著高于常規(guī)FET 組（43.69%vs.33.04%，P＜0.05），兩組間的生化妊娠率、臨床妊娠率、晚期自然流產(chǎn)率、多胎分娩率差異均無統(tǒng)計學意義。

本研究調(diào)整女方年齡、子宮內(nèi)膜厚度和移植胚胎天數(shù)（D5/D6）等混雜因素對臨床妊娠結(jié)局的潛在影響，在兩組之間進行了1∶2 的PSM，隨機篩選出PGT?FET組中的103個周期和常規(guī)FET組中的206個周期，并比較了匹配后兩組患者的一般基線資料及周期內(nèi)情況（表1）。結(jié)果顯示兩組間的女方年齡、男方年齡、移植前內(nèi)膜厚度、移植胚胎天數(shù)占比差異均無統(tǒng)計學意義。在此基礎(chǔ)上，分析兩組FET 的臨床妊娠結(jié)局，結(jié)果顯示：PGT?FET 組早期自然流產(chǎn)率顯著低于常規(guī)FET 組（11.11%vs.27.18%，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義而活產(chǎn)率高于常規(guī)FET組（43.69%vs.32.52%，P=0.05），但差異無統(tǒng)計學意義；兩組間的生化妊娠率、臨床妊娠率、晚期自然流產(chǎn)率、多胎分娩率差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 PSM 后PGT?FET 組與常規(guī)FET 組的人群特征描述及臨床結(jié)局比較

2.2 PGT?A、PGT?SR、PGT?M 周期的人群特征描述及臨床結(jié)局比較

103 個PGT?FET 周期中56 個為PGT?A，33 個為PGT?SR，14 個為PGT?M，均采用二代測序法進行全染色體CNV分析，以篩選整倍體囊胚進行移植。比較了PGT?A、PGT?SR、PGT?M 凍融胚胎的人群特征及臨床結(jié)局。結(jié)果顯示3 組間的女方年齡、男方年齡等基線資料差異無統(tǒng)計學意義，周期數(shù)據(jù)提示兩組移植前子宮內(nèi)膜厚度、第5 天囊胚、第6 天囊胚（D5、D6）占總體移植胚胎（D5+D6）的比例，差異均無統(tǒng)計學意義。

在此基礎(chǔ)上，分析3 組間FET 后的臨床妊娠結(jié)局。結(jié)果顯示，PGT?A、PGT?SR、PGT?M凍融胚胎3組間的生化妊娠率、臨床妊娠率、早期自然流產(chǎn)率、晚期自然流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、多胎分娩率差異均無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 PGT?A、PGT?SR、PGT?M周期的人群特征描述及臨床結(jié)局比較

3 討論

既往研究顯示，ART 的總?cè)焉飦G失率約29%，其中58%發(fā)生于妊娠6周之內(nèi)，而妊娠超過20周的妊娠丟失率僅為2%［11］。妊娠丟失的主要原因有高齡、既往流產(chǎn)史、感染、肥胖和激素水平異常等［12］。早期妊娠丟失是指妊娠12周內(nèi)的妊娠丟失，是評價ART 成功率的重要指標之一［13］，ART 相關(guān)的妊娠丟失也主要發(fā)生在妊娠早期［14］。自然流產(chǎn)的因素很多，其中，50%～60%的自然流產(chǎn)與胚胎染色體異常相關(guān)［15］。35 歲以后，女性的生育力明顯下降［16］，高齡患者的卵子由于氧化應(yīng)激損傷累積等原因，在減數(shù)分裂時容易發(fā)生錯配、重組、線粒體減少以及紡錘體著絲粒異常等，卵子非整倍體率較年輕女性增高，從而導(dǎo)致胚胎染色體異常，發(fā)生早期妊娠丟失［17］。紡錘體聚合檢驗點是細胞減數(shù)分裂Ⅰ期同源染色體和減數(shù)分裂Ⅱ期姐妹染色單體能正確分離的保障。隨著年齡的增長，卵母細胞內(nèi)紡錘體聚合檢驗點蛋白表達下降，容易發(fā)生染色體分離缺陷，導(dǎo)致生殖細胞非整倍發(fā)生率升高［18］。

研究報道對高齡女性患者卵母細胞的第一極體和第二極體進行活檢，熒光原位雜交分析（fluo?rescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）結(jié)果顯示，高齡女性卵母細胞的非整倍體率顯著增加［19］。而對體外受精中未受精的MⅡ卵母細胞進行了R顯帶技術(shù)分析，證明女性年齡和卵母細胞非整倍體發(fā)生率呈正相關(guān)［20］。

另有報道，應(yīng)用染色體微陣列技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）檢測自然流產(chǎn)組織的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，結(jié)果顯示異常結(jié)果檢出率為55.34%。其中，相較于年齡＜35 歲的患者，≥35 歲患者的流產(chǎn)組織染色體異常檢出率顯著升高（83.33%vs.51.65%），提示高齡是導(dǎo)致胚胎染色體異常發(fā)生率升高的高危因素［21］。既往Franasiak等［22］的研究也證實了這一結(jié)論。

對PGT 治療周期中女性不同年齡段的胚胎正常率及臨床結(jié)局進行的回顧性分析顯示，女性年齡≥35 歲時，胚胎染色體正常率為29.1%，顯著低于年齡＜25 歲患者（50.00%）及25～34 歲患者（50.15%）。年齡≥35歲時女性臨床妊娠率為40.00%，顯著低于年齡＜25 歲的患者（83.33%）及25～34 歲的患者（82.50%），提示女性年齡升高會顯著降低臨床妊娠率和胚胎的染色體正常率［23］。

既往研究對年齡≥35歲的不孕癥高齡病例使用多因素邏輯回歸分析，推測其接受ART后妊娠丟失的危險因素。結(jié)果顯示年齡≥35歲的高齡不孕癥患者，年齡、既往妊娠流產(chǎn)史（≥3 次）和hCG 日子宮內(nèi)膜厚度是影響其接受ART 治療后發(fā)生妊娠丟失的主要危險因素［24-25］。在此基礎(chǔ)上，另有研究對高齡患者的年齡進一步分組，將患者年齡分為36～37 歲組、38～39 歲組、40 歲組、41 歲組、42 歲組、43 歲組、44 歲組和45～48 歲組，進一步分析不同年齡段早期妊娠丟失率與胚胎移植數(shù)及胚胎質(zhì)量的關(guān)系，結(jié)果顯示年齡是導(dǎo)致早期妊娠丟失的無法補救的危險因素，隨年齡增長，患者臨床妊娠率、活產(chǎn)率降低，早期妊娠丟失率顯著升高，并且各年齡組早期妊娠丟失率與胚胎質(zhì)量和移植胚胎數(shù)沒有顯著關(guān)系［26］。

關(guān)于高齡患者的PGT?A 是否可以改善患者自然流產(chǎn)結(jié)局仍存在廣泛爭議。一項多中心隨機對照試驗表明，與僅根據(jù)形態(tài)學標準進行胚胎選擇相比，高齡患者中，PGT?A 可顯著提高35～40歲女性每移植周期的持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率［5］。但是，也有學者對這篇研究提出質(zhì)疑［6］。一項回顧性隊列研究發(fā)現(xiàn)，35～37歲及＞37歲的患者中，非PGT?A組與對照組在活產(chǎn)率和流產(chǎn)率方面差異均無統(tǒng)計學意義［27］。此外，既往薈萃分析結(jié)果顯示，在對流產(chǎn)率進行年齡亞組分析后，35歲以上的婦女采取PGT?A時，PGT?A組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義［28］。但是多數(shù)研究并未區(qū)分第3天卵裂期胚胎活檢或者第5天囊胚活檢，并且FET周期中沒有統(tǒng)一內(nèi)膜準備方案。

考慮到年齡為不可逆轉(zhuǎn)因素，本研究并未對患者年齡進一步分組。同時考慮了子宮內(nèi)膜厚度及移植胚胎不同天數(shù)對臨床結(jié)局的潛在影響，對初始數(shù)據(jù)進行了PSM 以控制混雜因素的影響。著重探討PGT技術(shù)對結(jié)局的影響，試圖證實可以通過篩除高齡患者的非整倍體胚胎來降低其早期自然流產(chǎn)率。研究結(jié)果顯示，PGT 可以顯著降低高齡患者FET周期的早期自然流產(chǎn)率。提示對于符合PGT指征的不孕癥患者，應(yīng)考慮盡早接受PGT 助孕治療。同時，我們也注意到，匹配前相較于常規(guī)FET 組，PGT?FET 組患者早期自然流產(chǎn)率顯著降低、活產(chǎn)率顯著升高。而匹配后PGT?FET組活產(chǎn)率雖有升高，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能與本研究樣本量小相關(guān)。此外，本研究對PGT 周期進行了更細化的分析，PGT 周期的3 個亞組PGT?A、PGT?SR、PGT?M 周期的人群特征描述及臨床結(jié)局的差異均無統(tǒng)計學意義。本研究尚為一項初步的回顧性研究，在此基礎(chǔ)上，計劃進一步進行隨機分組的前瞻性隊列研究，為PGT廣泛應(yīng)用于高齡患者提供理論基礎(chǔ)。