急性呼吸窘迫綜合征新生兒血漿miR?6833?3p的表達水平及診斷效能

吳 越，邱 峰

1南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒醫(yī)療中心，江蘇 南京 210008；2南京醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院腦血管病救治中心，江蘇南京 210029

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指機體在受到各種病理刺激（如創(chuàng)傷、感染、缺氧、休克等）后發(fā)生的肺部急性炎癥反應，主要病理變化為急性彌散性肺泡上皮細胞損傷及肺泡毛細血管內皮細胞損傷，臨床上表現(xiàn)為進行性的呼吸窘迫和難治性的低氧血癥，是新生兒臨床常見的危急重癥［1］。據(jù)統(tǒng)計，新生兒ARDS 占所有需要機械通氣新生兒的1%～2%，病死率為50%～60%，是導致新生兒死亡的重要原因之一［2-4］。然而，目前對于新生兒ARDS 的診斷仍然依靠臨床指標的綜合診斷，尚未找到特異性的標志物。因此，尋求一種有效、準確的生物學標志物以提高對新生兒ARDS的診斷效能尤為重要。

作為一類新型的基因調控分子，微小核糖核酸（miRNA）可通過影響靶基因的表達而調控炎癥通路和免疫反應，在ARDS發(fā)病過程中起重要作用［5］。現(xiàn)有的研究對新生兒ARDS發(fā)生發(fā)展機制僅僅在基因水平進行了初步揭示［6］。通過檢索miRNA 與新生兒ARDS關系發(fā)現(xiàn)，該類研究仍較少［7］，miRNA是否參與了新生兒ARDS發(fā)展過程中的炎性調控也少見報道，以該類miRNA作為干預靶標從而防治新生兒ARDS的效果并不理想。本研究通過篩選與新生兒ARDS 有關的差異表達miRNA，獲得可能的靶基因miR?6833?3p，并進一步進行驗證，初步探究miR?6833?3p在新生兒ARDS發(fā)病中的作用機制，通過檢測新生兒ARDS 血清miR?6833?3p 的表達水平，分析其對新生兒ARDS的診斷效能。

1 對象和方法

1.1 對象

選取南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院2019年1月—2020年1月新生兒重癥監(jiān)護病房收治的25例ARDS患兒為ARDS 組，同期選取32例在本院的普通新生兒（無嚴重疾病、無需氧療的新生兒）為對照組。入選標準：①符合《新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒標準（2017 年版）》診斷標準［8］；②經(jīng)影像學檢查（X線胸片顯示雙肺彌漫性陰影伴肺水腫改變，超聲心動圖檢查無左心房高壓表現(xiàn)），并結合臨床癥狀及體征確診；③急性起病，機械通氣時間≥72 h，胎齡＞34 周。排除標準：①肺外嚴重感染；②原發(fā)性肺泡表面活性物質缺乏、先天性心臟病及先天性代謝紊亂；③肺和胸壁的畸形及其他嚴重的先天畸形。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，并與患兒家屬簽署知情同意書。

急性生理與慢性健康（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）評分中的急性生理評分（acute physiology score，APS），包含生命體征、血常規(guī)、血氣分析等共12項常用指標，指標正常為0分，如各項指標偏離正常值，根據(jù)其偏離程度記錄1～4 分，總分相加以反映ARDS 患兒的疾病嚴重程度。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

所有患兒均于確診次日采集空腹靜脈血3 mL，置于未加抗凝劑的離心管中，2 h 內3 500g離心5 min，進行血清分離，DEPC 處理后于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。選取上述血清解凍并加入RNA提取液TRIzol（Ambion公司，美國），室溫下孵化10 min后加入200 μL 氯仿，在振蕩器上（14 000g離心15 min）進行充分混勻。隨后將上清轉至新的試管中并加入500 μL 異丙醇進行RNA 提取，通過再次離心及加入75%的乙醇洗滌，分光光度儀對總RNA進行識別，處理后于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNA的分離及提取

每100 μg的總RNA加入5倍體積的細胞溶解緩沖液，隨后加入1/10體積的勻漿液添加劑及1/3體積的100%乙醇，在冰上充分混勻過濾并以5 000 r/min離心1 min。隨后移除上清液體加入700 μL miRNA洗滌液以15 000 r/min離心1 min，再次加入500 μL洗滌液以5 000 r/min離心1 min并重復2次，去除殘液后提取50 μL 置于濾器中，室溫孵育2 min，完畢后以10 000 r/min 離心1 min，最后提取miRNA 并于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 miRNA標記、芯片雜交及生物信息學分析

將提取好的總RNA 用miRCURYHy3TM/Hy5TMPower Labeling Kit（Exiqon，Vedbaek 公司，丹麥）進行miRNA標記。將RNA溶解于事先配制好的雜交液（15%甲酰胺2.4 μL，0.2%SDS 3.2 μL，3×SSC 2.4 μL，50×Denhardt 1.6 μL，DEPC 6.4 μL）中，通過升溫并混勻后放置于-20 ℃環(huán)境下10 min，隨后于95 ℃下變性3 min。將RNA 加至3.0 版本microRNA 芯片，漂洗后于室溫下離心甩干。

用Axon GenePix 4000B microarray scanner（Ax?on Instrument 公司，美國）進行掃描，掃描圖像導入GenePix Pro 6.0 software（Axon）對miRNA芯片掃描數(shù)據(jù)進行提取分析。miRNA 數(shù)據(jù)用Median normaliza?tion 進行標化，miRNA 信號值在所有組中≥50 才被選擇，重復的miRNA 取平均值。數(shù)據(jù)分析采用Mann?Witney檢驗，差異表達的miRNA的選擇標準：差異倍數(shù)＞2 或＜0.5，P＜0.01。表達芯片熱圖用MEV software（v4.6，TIGR）進行制作。實驗和后續(xù)的基因芯片數(shù)據(jù)分析由北京博奧生物有限公司輔助完成，隨機取10 個樣本制作芯片。選取靶基因數(shù)據(jù)集（TargetScan 與microrna.org 兩個數(shù)據(jù)庫預測的靶基因交集）與候選數(shù)據(jù)集（與目標基因表達相關的差異基因）進行交集，進行基因功能和信號通路分析（GO 和Pathway 分析），找出可能的作用靶標。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測

提取不同組患兒血液中的RNA，合成針對miRNA和相應內參的反轉錄引物，使用實時熒光定量檢測試劑盒（Qiagen 公司，美國）進行逆轉錄合成cDNA從而進行實時定量PCR 反應實驗。其中包括2 μL dNTPs、10 × PCR 緩沖液2.5 μL、Taq 聚合酶2 U、Sybergreen Ⅰ終濃度0.25×、10 μmol/L上游引物1 μL、10 μmol/L下游引物1 μL、4 μL cDNA模板以低速短暫離心。相應參數(shù)設置：95 ℃10 min；95 ℃10 s、60 ℃60 s，45 個循環(huán)；在60 ℃處進行單點熒光檢測收集。反應產物相對表達量使用公式2-ΔΔCT法進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

將所有數(shù)據(jù)輸入SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較則用χ2檢驗。通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miR?6833?3p在ARDS患兒中的診斷效能，并計算診斷靈敏度、特異度及準確性，曲線下面積（area under cure，AUC）比較采用Z檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組基本臨床資料的比較

兩組性別、胎齡、出生體重、母親年齡、剖宮產等一般資料的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05，表1）。

表1 兩組臨床基本資料的比較Table 1 Comparison of basic clinical data of two groups

2.2 miRNA芯片測試結果

兩組血清miRNA進行定量分析，共篩選出24個與新生兒ARDS 相關的高表達（差異倍數(shù)為2 倍以上且組內差異?。┑牟町惢颉Ｔ?4 個miRNA 中有14個在ARDS組血清中明顯上調，10個miRNA明顯下調。進一步進行差異篩選發(fā)現(xiàn)，這24個基因中有4 個表達上調和4 個表達下調均超過5 倍且組內差異微小的基因，4個上調的分別是miR?31?5p、miR?4754、miR?6833?3p 和miR?192?3p，4 個表達下調的基因分別是miR?362?3p、miR?11a、miR?7a?2?3p 和miR?1382。

2.3 篩選基因的實時熒光定量PCR驗證

為進一步避免miRNA 基因之間互相雜交的缺點，使用實時熒光定量PCR對篩選的如上基因進行了驗證，結果發(fā)現(xiàn)miR?6833?3p在ARDS組中的表達為對照組的9.23倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且8 個miRNA 在兩組間均存在明顯差異表達，其結果與miRNA芯片的初篩結果基本一致（圖1）。

圖1 驗證miRNA在ARDS組及對照組血清中的表達Figure 1 Verification of the miRNAs expression in serum of ARDS group and control group

2.4 miR?6833?3p生物信息學分析

靶基因數(shù)據(jù)集共預測到3 485 個miR?6833?3p的靶基因，與候選數(shù)據(jù)集（與miR?6833?3p表達相關的差異基因）進行交集，綜合分析得出結果。miR?6833?3可能與PI3?K/Akt、MAPK、ETIF及DUSP信號通路相關（表2），其中與PI3?K/Akt、MAPK信號通路相關的可能性最大（P＜0.001）。

表2 miR?6833?3p靶基因生物學分析Table 2 Biological analysis of target genes of miR?6833?3p

2.5 血漿中miR?6833?3p與APACHEⅡ評分的相關性及診斷效能

Pearson 相關分析結果提示，ARDS 患兒血漿中miR?6833?3p 的濃度和APACHEⅡ評分中的APS 評分呈正相關（r=0.731，P＜0.001，圖2）。ROC曲線分析顯示，血漿miR?6833?3p對預測ARDS患兒的AUC為0.848，其診斷最佳閾值為1.03，約登指數(shù)最大值為0.59，此時miR?6833?3p 的診斷靈敏度為84.55%，特異度為75.36%（圖3）。

圖2 新生兒ARDS 血漿中miR?6833?3p 的濃度和APS 評分相關性Figure 2 Correlation between miR?6833?3p in serum of neonatal ARDS and APS scores

圖3 血漿中miR?6833?3p對診斷新生兒ARDS的ROC曲線Figure 3 ROC curve of miR?6833?3p in serum for diagno?sis of neonatal ARDS

3 討論

新生兒ARDS 病死率高，是新生兒死亡的重要原因之一［2-4］，由于缺乏特異性標志物，僅依靠臨床診斷，治療容易滯后，影響最終新生兒的結局。由于其特定的性質決定了miRNA 在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有決定性的病理生理調控優(yōu)勢［9-11］。既往研究通過建立ARDS細胞動物模型及成人患者血液中篩選了部分差異表達的miRNA［12-13］，這些結果說明miRNA 在ARDS 疾病的發(fā)展過程中起到一定的作用，但前期該類研究未對差異表達模式及規(guī)律進行深入分析研究，且目前仍未見新生兒相關ARDS 的miRNA 研究。通過文獻檢索進一步分析miR?6833?3p的研究現(xiàn)狀，回顧發(fā)現(xiàn)miR?6833?3p國內外尚未見有關文獻報道，由此可見該miRNA可能是功能尚未明確的新miRNA。本研究也利用實時熒光定量PCR 及相關基因芯片分析對該miRNA 做了初步研究，miR?6833?3p可能是新生兒ARDS潛在的一種新的標志物。本研究顯示，miR?6833?3p 在新生兒ARDS 中的表達水平明顯升高，且其升高程度與患者疾病嚴重程度有一定的相關性，相應的ROC 曲線也提示miR?6833?3p 對預測新生兒ARDS具有一定的診斷價值。

多項研究提示miRNA 可參與細胞的免疫應答和氧化應激反應，miRNA在肺組織使肺小血管滲透性增加引起肺泡水腫，最終導致肺泡上皮細胞進入程序性死亡［14-15］，提示miRNA 的異常表達可通過免疫炎性反應對ARDS的病程及進展起重要作用。本研究通過對新生兒ARDS 的研究也發(fā)現(xiàn)類似的結果，miR?6833?3p 在ARDS 新生兒血液中明顯升高，由于miRNA 是通過細胞的主動分泌以外泌體或結合脂蛋白形式穩(wěn)定存在于血液中［16］，而血液中的miRNA可通過受體結合的胞吞方式再重新進入細胞內，從而完成該miRNA 在不同細胞間的中介作用［17-18］。由此推測外周血液中的miR?6833?3p 可能間接反映出肺部組織細胞miR?6833?3p的變化。結合本研究結果中信號通路的預測，本研究中ARDS患者血中miR?6833?3p 的表達明顯升高，其機制可能是miR?6833?3p 通過PI3?K/Akt 機制影響新生兒ARDS的進展。PI3?K/Akt通路可以介導脂多糖調節(jié)肺微血管內皮細胞功能［19］，研究證明在ARDS 患者中p?Akt 蛋白表達明顯上升，該蛋白的功能表達可以促進肺血管損傷和ARDS病情進展［20］。當血液中miRNA?6833?3p增多，可以進一步激活PI3?K/Akt通路，促使大量炎性因子釋放，損傷肺小血管內皮細胞的屏障功能，炎性液體滲出，從而加重肺部水腫，二氧化碳潴留加重，有效氣體交換受限，新生兒呼吸困難加重，同時氧自由基也隨之增加，肺組織損傷進一步加重導致ARDS病情惡化［21-22］。但miRNA?6833?3p 通過PI3?K/Akt 機制對肺組織的調節(jié)有待后期實驗進一步深入研究。

由于新生兒ARDS 評分的特殊性，APACHE Ⅱ評分中主要反映新生兒疾病嚴重程度的是生命體征、血常規(guī)及血氣分析結果，此為APS的組成部分。本研究中的相關性分析顯示血液中miR?6833?3p的含量與APACHEⅡ評分中的急性生理評分項APS呈明顯正相關，此結果也與前期研究結果一致［23-24］。從側面也進一步提示miR?6833?3p 參與了新生兒ARDS的進展過程，隨著血清中升高的miR?6833?3p 與編碼區(qū)結合作用，靶基因相關蛋白降解或抑制轉錄翻譯，炎性基因在血液中的表達被進一步調控，使相關炎性因子大量釋放，炎性反應進一步激活新生兒肺組織的免疫應答，促進炎性反應級聯(lián)瀑布效應，最終加重ARDS病情［25］。

本研究通過繪制血清miR?6833?3p水平判斷新生兒ARDS 預后的ROC 曲線，曲線下面積大于0.5，靈敏度及特異度均超過75%，進一步說明血液中miRNA?6833?3p 的表達水平可以評估新生兒ARDS診斷及預后判斷情況，該miRNA 可能作為新生兒ARDS一種潛在的新的生物標志物。但由于本研究為單中心研究，病例數(shù)有限，樣本量偏少，且來源較單一，尚缺乏多中心的研究結果，仍需大規(guī)模多中心大樣本量進行進一步的前瞻性研究以證實miRNA?6833?3p 在新生兒ARDS 中的臨床應用價值及其與疾病嚴重程度和炎性因子的關系。下一步擬擴大樣本量進一步研究靶基因，明確其作用的信號通路及靶點，相關研究的進一步深入將為新生兒ARDS的臨床診療提供新的思路。