長鏈非編碼RNA H19變異基因型與中國人群腎細胞癌發(fā)病風險及預(yù)后的相關(guān)性研究

鄧夏珩，呂 強，李鵬超*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科，2泌尿外科，江蘇 南京 210029

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是腎癌的主要類型，分別占男性和女性所有惡性腫瘤的5%和3%［1-2］，其中高達17%的患者在診斷時出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其余30%的患者甚至在手術(shù)治療后也會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［3-4］，總體預(yù)后較差。腎癌的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，涉及環(huán)境和遺傳因素之間的相互作用［5］。近年來，基因變異已被廣泛研究并證明影響RCC的易感性、進展和預(yù)后［6-7］。

長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的內(nèi)源性細胞核糖核酸，缺乏蛋白質(zhì)編碼能力［8］，越來越多的證據(jù)表明lncRNA 在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用［9］。lncRNAH19 是一種父系印記基因，位于人類染色體11p15.5上［10］，通過調(diào)節(jié)miRNA功能及介導DNA甲基化參與重要的生物學和病理學過程［11］。H19 與胰島素樣生長因子2（insulin like growth fac?tor 2，IGF?2）基因密切相關(guān)，該基因也位于受甲基化印記影響的區(qū)域，參與胎兒的正常生長和發(fā)育［12］，同時也在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮功能［13］。研究表明H19異常表達與多種惡性腫瘤包括膀胱癌、乳腺癌、食管癌及腎細胞癌的發(fā)生相關(guān)［14］。Wang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，H19 在RCC 腫瘤組織中高表達，并與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，且H19 表達是RCC 患者臨床預(yù)后的獨立預(yù)測因子。新近研究一致表明H19 基因多態(tài)性與各種癌癥發(fā)病風險及預(yù)后相關(guān)，包括胃癌［16］、結(jié)直腸癌［17］、膀胱癌［18］和乳腺癌［19］等。最近一項薈萃分析表明，H19 rs2839698與胃腸癌風險增加有關(guān)［20］。鑒于H19 在RCC 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，其基因變異可能與RCC發(fā)病及預(yù)后相關(guān)。然而目前并沒有研究探討此類問題，因此本研究選擇H19 最被廣泛研究的4 個多態(tài)性：rs2839698、rs217727、rs3741216 和rs3741219，并在一項兩階段病例對照研究中評估其與RCC 風險及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象

本研究始于2004年5 月，得到南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。所有入組者均為漢族，無血緣基因聯(lián)系。所有患者均經(jīng)組織病理學證實患RCC，既往接受過化療、放療或有其他類型惡性腫瘤的患者被排除在本研究之外。根據(jù)WHO標準及TNM系統(tǒng)進行分級，分為局部（Ⅰ期和Ⅱ期）及晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）RCC。對照組為門診體檢患者，并按照性別和年齡（±5歲）進行頻率匹配，排除與患者有遺傳關(guān)聯(lián)或有癌癥病史的患者。本研究設(shè)計為兩個階段：實驗組于2004年5月—2009年10月共納入342例RCC患者和361例對照，每6個月在門診隨訪患者，終點為患者死亡或丟失訪。其中44 例（12.9%）患者缺少足夠的隨訪信息被排除，最長隨訪時間為72.0個月，中位隨訪時間為25.1個月。驗證組至今共納入672例RCC患者和702例對照。所有患者信息均通過標準問卷調(diào)查獲得，獲得知情同意后，捐獻5 mL 靜脈血。本研究對1 014 例RCC 患者及1 063 例健康對照4 種基因多態(tài)性的多種組合進行分型與分析。

1.2 方法

1.2.1 多態(tài)性選擇

使用UCSC網(wǎng)站（http：//genome.ucsc.edu/）對位于人染色體11p15.5（位置20164062021693）H19 基因及其啟動子中的基因多態(tài)性進行鑒定，在千人基因組計劃的東亞人群中以定位等位基因頻率＞0.05 為標準。本研究最終選擇并研究rs2839698、rs217727、rs3741216和rs3741219 4個標記多態(tài)性。

1.2.2 DNA提取和基因分型

通過蛋白酶K消化及氯仿從外周血中提取基因組DNA，4 種多態(tài)性基因分型使用預(yù)先設(shè)計的Taq?Man SNP基因分型試劑盒（Applied Biosystems 公司，美國）進行分析，每個單核苷酸多態(tài)性的引物和探針序列可根據(jù)要求提供（表1）。在384 孔ABI 7900HT實時聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)中進行擴增和分析，使用SDS 2.3軟件進行等位基因鑒別。每個平板內(nèi)均包括質(zhì)控品，以確保基因分型的準確性。隨機選擇約10%的樣本進行重復(fù)基因分型，結(jié)果100%一致。

表1 基因多態(tài)性的引物與探針序列Table 1 Primers and probe sequences of polymorphisms

1.3 統(tǒng)計學方法

基因突變的等位基因頻率在分析前使用擬合優(yōu)度χ2檢驗檢測是否偏離Hardy?Weinberg 平衡，采用Student’st檢驗（連續(xù)變量）和χ2檢驗（分類變量）評估病例和對照組之間的人口統(tǒng)計學特征、特定變量及基因型頻率分布的差異?；贐enjamin?Hoch?berg 方法對4組單核苷酸多態(tài)性的多重P值比較進行FDR矯正，當FDR矯正后的P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。H19多態(tài)性與RCC風險和腫瘤特征的關(guān)系通過計算OR值和95%置信區(qū)間（95%CI）進行評估。生存時間為RCC診斷時至死亡或最后一次隨訪日期，Kaplan?Meier曲線評估臨床特征與H19不同基因型的生存狀態(tài)。采用COX回歸分析計算HR值和95%CI評估影響RCC預(yù)后的獨立危險因素。所有分析均使用SAS 9.1.3，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RCC患者及健康對照的臨床特征

所有納入研究的RCC 患者及健康對照的特征分布見表2。其中，病例組與對照組在年齡、性別和飲酒狀況方面無顯著差異（P＞0.05），病例組中吸煙者、高血壓患者與糖尿病患者多于對照組（分別為P=0.021、P＜0.001、P＜0.001）。65.7%的患者臨床分期處于Ⅰ期，而19.2%的患者處于Ⅱ期，6.9%和8.2%的患者分別位于Ⅲ和Ⅳ期。21.4%、51.4%、20.6%和6.6%的患者病理分級分別為Ⅰ至Ⅳ級。

表2 腎細胞癌患者與健康對照的特征分布Table 2 Characteristic distribution of patients with renal cell carcinoma and healthy controls

2.2 H19基因多態(tài)性與RCC發(fā)病風險的關(guān)系

H19 rs2839698、rs217727、rs3741216和rs3741219基因多態(tài)性與RCC發(fā)病風險的關(guān)系見表3，對照組4種多態(tài)性的基因型頻率均符合HWE（P＞0.05）。病例組與對照組中rs2839698 基因型分布顯著不同（P=0.003），經(jīng)多次比較后仍保持顯著性（FDR=0.013）。與攜帶rs2839698 CC 基因型的個體相比，攜帶rs2839698變異TT基因型的個體與顯著增加的RCC 發(fā)病風險相關(guān)（P=0.005，OR=1.37，95%CI=1.34～3.02）。采用隱性遺傳模型，結(jié)合CT/TT 基因型，與rs2839698CC基因型相比，RCC風險也顯著增 加（P=0.012，OR=1.13，95%CI=1.02～1.55）。但未發(fā)現(xiàn)其他多態(tài)性與RCC 發(fā)病風險的證據(jù)，結(jié)果表明H19 rs2839698 基因多態(tài)性可能賦予個體RCC 的遺傳易感性。

表3 H19基因多態(tài)性在病例組與對照組中的分布頻率及其與RCC風險的關(guān)系Table 3 Frequencies of H19 polymorphisms of the cases and controls as well as the linkage with the risk of RCC［n（%）］

2.3 H19 rs2839698基因多態(tài)性對RCC患者臨床病理特征的影響

探究rs2839698基因型與病例組中RCC 腫瘤大小、臨床分期及病理分級之間的關(guān)系，以評估H19 rs2839698 基因多態(tài)性對RCC 疾病進展的影響。如表4所示，未觀察到rs2839698基因型與病理分級之間的顯著關(guān)聯(lián)；然而，rs2839698 CT/TT 基因型在腫瘤大小超過4 cm 及臨床晚期患者中更常見（CT/TTvs.CC：P=0.003，OR=1.35，95% CI=1.10～1.73；P=0.010，OR=1.63，95%CI=1.08～2.21）。結(jié)果表明，與rs2839698 CC 基因型患者相比，CT/TT 基因型患者更可能出現(xiàn)臨床高分期。

表4 H19 rs2839698基因多態(tài)性與RCC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 4 H19 rs2839698 polymorphism association with clinicopathological features of RCC patients ［n（%）］

2.4 H19 rs2839698基因多態(tài)性對RCC患者生存的影響

前階段結(jié)果證明rs2839698 基因多態(tài)性與RCC進展相關(guān)，采用Log?Rank 檢驗及Kaplan?Meier 分析評估rs2839698基因多態(tài)性與RCC患者生存之間的關(guān)系。rs2839698 基因多態(tài)性與RCC 患者生存顯著相關(guān)（Log?rankP=0.007，表5）。與攜帶rs2839698 CC 基因型的患者相比，攜帶rs2839698 TT 或CT/TT基因型的患者RCC 生存較差（HR=4.35，95%CI=1.65～16.92；HR=2.24，95%CI=1.10～4.59）。然而，在其他多態(tài)性和RCC 生存之間仍然沒有發(fā)現(xiàn)顯著的關(guān)聯(lián)證據(jù)。隨后，對RCC患者生存進行單因素與多因素COX 分析（表5 及圖1），單因素分析顯示臨床分期、病理分級和H19 rs2839698（隱性遺傳模型：CT/TTvs.CC）與腎細胞癌生存相關(guān)；在多因素分析中，臨床分期是影響RCC 生存的最主要預(yù)測因子，其次是病理分級（P＜ 0.001，HR=15.51，95%CI=5.94～40.42；P＜ 0.001，HR=4.89，95% CI=2.58～10.85）。有趣的是，H19 rs2839698（CT/TTvs.CC）也是RCC 生存的獨立預(yù)測因子（P=0.027，HR=2.24，95%CI=1.10～4.59）。

表5 H19 rs2839698基因多態(tài)性與RCC患者生存的關(guān)系Table 5 H19 rs2839698 polymorphism association with survival of RCC patients

圖1 H19 rs2839698基因多態(tài)性對RCC患者生存的影響Figure 1 Effects of H19 rs2839698 polymorphism on survival of RCC patients

3 討論

本研究探討了H19 基因多態(tài)性與中國人群RCC 易感性及預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果表明H19 rs2839698 變異基因型與RCC 風險增加相關(guān)，且rs2839698 變異基因型與較大的腫瘤和晚期RCC 有關(guān)；在多變量分析中，它與臨床分期和病理分級均是患者生存的獨立預(yù)后預(yù)測因子。

lncRNA H19 位于染色體11p15.5，作為癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程［21］。H19屬于高度保守的印記基因，存在3種轉(zhuǎn)錄變體，分別包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，通過調(diào)節(jié)RNA 及核糖體參與炎癥發(fā)生、血管形成、細胞凋亡及死亡等進展［22-23］。生物信息學研究表明，腦缺血發(fā)生時H19的關(guān)聯(lián)基因主要富集于甲基化、基因印記、RNA 折疊及DNA轉(zhuǎn)錄［24］。中國人群研究顯示，H19 基因高表達與乳腺癌發(fā)生風險呈正相關(guān)，且在ER（+）及HER2（+）患者中差異表達更為明顯［25］。研究表明，H19 在腎腫瘤中的表達水平明顯高于臨近的正常組織，且高表達與臨床分期級別高及預(yù)后較差明顯相關(guān)［15］；He等［26］表明H19在腎癌中高度表達，通過miR?29a?3p/E2F1 途徑參與RCC 的轉(zhuǎn)移和侵襲。越來越多的證據(jù)表明，基因變異在癌癥易感性和預(yù)后中起重要作用，H19 基因多態(tài)性也在各種惡性腫瘤中被廣泛研究。Ge等［27］研究表明rs217727 GG基因型攜帶者在肝細胞癌中H19的表達遠高于GA及AA基因型攜帶者，表明17727G＞A突變可能調(diào)控H19表達。結(jié)果與我們一致，都表明rs2839698突變基因是胃癌［20］、結(jié)直腸癌［17］和肝癌［28］的獨立危險因素。Yang 等［28］發(fā)現(xiàn)H19 rs2839698變異基因型不僅增加了肝癌風險，而且也是吸煙亞組肝癌預(yù)后的潛在遺傳預(yù)測因子，另外也發(fā)現(xiàn)H19 rs2839698CT 基因型的患者預(yù)后不良。一項大型多腫瘤Meta 分析顯示rs2839698變異基因型在亞洲人群中與腫瘤風險增加相關(guān)，而在高加索人群中與腫瘤風險降低相關(guān)［29］。本研究結(jié)果和既往其他腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)基本一致，首先兩階段病例對照研究分析發(fā)現(xiàn)H19 rs2839698 位點的突變等位基因T是腎癌的發(fā)病危險因素，與野生基因型攜帶者相比較，攜帶TT基因型的個體腎癌發(fā)病風險增加了1.37倍。此外，在患者群的分層分析中發(fā)現(xiàn)，突變基因型攜帶患者更易罹患較大腫瘤以及臨床高分期腎癌，風險分別為野生型患者的1.35 倍、1.63 倍，總體死亡風險為野生型患者的4.35 倍。大量研究證實H19 是促癌基因，如前所述，其不僅在腎癌中高表達，參與腎癌的發(fā)生發(fā)展，在其他多種腫瘤中，H19 也具有類似作用。因此，我們推測H19 rs2839698 位點的突變等位基因T 具有潛在的生物學功能，其可能通過調(diào)控H19的表達甚至功能而影響到腎癌的易感性、進展以及患者預(yù)后。

新近研究表明基因變異可能通過改變DNA 及RNA的二級結(jié)構(gòu)來發(fā)揮作用［30］，影響miRNA與特定區(qū)域的結(jié)合親和力。研究表明，LINC00673 中rs11655237處的G＞A變化可以為miR1231產(chǎn)生一個靶向位點，以一種特殊的等位基因方式削弱了LINC00673的作用，增加胰腺癌易感性［31］。結(jié)直腸癌研究也表明MALAT1中rs664589的等位基因C＞G改變，改變了miR?195?5p與突變區(qū)的結(jié)合親和力，導致MALAT1表達增加，促進結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移［32］。SNPfold 預(yù)測H19 的二級結(jié)構(gòu)隨著rs2839698 C/T 等位基因突變發(fā)生改變，表明rs2839698 突變可能通過改變H19 的二級結(jié)構(gòu)來影響RCC 的易感性和預(yù)后。此外，H19 rs2839698 多態(tài)性位點位于H19基因的3′UTR 區(qū)域，可能通過改變相關(guān)miRNA 和H19 3′UTR 區(qū)域的結(jié)合而影響H19的表達和功能。生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/ln?cRNASNP#/），H19 rs2839698 位點等位基因從C 突變?yōu)門 時，可能會導致hsa?miR?24?1?5p、hsa?miR?4486、hsa?miR?566 以及hsa?miR?24?2?5p 等結(jié)合失常，但是產(chǎn)生了hsa?miR?612、hsa?miR?5189、hsa?miR?1285?3p 以及hsa?miR?3187?5p的結(jié)合位點。我們推測，H19 rs2839698 位點突變可能導致了miRNA 結(jié)合狀態(tài)的變化而影響其表達，進一步參與到腎癌的發(fā)展和預(yù)后。在上述這些miRNA 中，hsa?miR?566被報道在腎癌組織和細胞中高表達，并參與了腎癌細胞的侵襲行為［33］。因此，H19 rs2839698 是否和hsa?miR?566共同參與腎癌的發(fā)生發(fā)展，可能是未來的一個研究方向。

本研究也有一定局限性。首先，目前的病例對照研究是基于醫(yī)院就診人群，而不是基于總體人群，因此，不能排除特定基因型相關(guān)的個體存在選擇偏差的可能性。此外，我們僅初步探討H19 rs2839698基因型突變與RCC發(fā)病和預(yù)后的關(guān)系，仍需深入研究其對上下游基因及ncRNA功能影響的具體機制。本研究優(yōu)勢在于采用了兩階段的設(shè)計，在一階段研究關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，進一步在二階段的研究中得到驗證，可以在一定程度上排除因群體選擇帶來的偏倚；此外，本研究的發(fā)現(xiàn)結(jié)合生物信息學預(yù)測結(jié)果，推測hsa?miR?566 可能與H19 rs2839698變異有關(guān)，為將來深入的功能研究提供了方向。

綜上所述，中國漢族人群lncRNA H19 rs2839698 變異與RCC 患者發(fā)病率及遠期預(yù)后密切相關(guān)，可能是RCC 易感性和生存的遺傳預(yù)測因子，但具體作用機制仍需進一步驗證。