VDAC1 通過誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞鐵死亡參與屋塵螨誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥

黃奕，林麗珊，黃浩華，董航明

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510515

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性（AHR）為特征的炎癥性疾病，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、呼吸困難、咳嗽或胸悶。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制由遺傳、環(huán)境。人體免疫等多個(gè)方面相關(guān)，在臨床上哮喘分為多種表型［1］，而在哮喘的所有表型中，都會(huì)出現(xiàn)了上皮損傷這一病理特征［2］。提示氣道上皮與哮喘密切相關(guān)，深入探討氣道上皮對(duì)哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞多種代謝反應(yīng)的中心，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、代謝、先天免疫、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此線粒體損傷可影響細(xì)胞代謝和能量產(chǎn)生，進(jìn)而引起一系列代謝紊亂和炎癥反應(yīng)［3］。目前認(rèn)為線粒體功能障礙與肺部疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）和特發(fā)性肺纖維化（IPF）［4-6］，可造成增殖、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞和活性氧（ROS）產(chǎn)生增加等影響。不同氣道細(xì)胞群中的線粒體功能障礙，包括肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，例如刺激上皮細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的激活，從而促進(jìn)成纖維過程［7］，但線粒體與哮喘的相關(guān)研究較少。為了更好地了解線粒體在哮喘中的作用并開發(fā)新的治療策略，有必要進(jìn)一步的進(jìn)行研究。

電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1（VDAC1）是是錨定線粒體外膜上的多功能蛋白，它可以調(diào)控線粒體與細(xì)胞其他組分之間的物質(zhì)代謝，維持細(xì)胞的生理功能；而在調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生、線粒體氧化酶應(yīng)激、Ca2+運(yùn)輸、物質(zhì)代謝等方面，VDAC1同樣參與其中［8］。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，VDAC1還可通過與Bax結(jié)合，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)［9］；因此VDAC1與線粒體功能息息相關(guān)，但近年來，有研究指出，在香煙煙霧、空氣污染、炎癥因素、缺氧等因素刺激下，VDAC1可發(fā)生寡聚化釋放損傷相關(guān)分子模式從而引起炎癥反應(yīng)，參與慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展［10-12］，而哮喘作為全身性的慢性炎癥疾病，我們認(rèn)為VDAC1參與了哮喘氣道炎癥的發(fā)生。

鐵死亡是一種程序性的細(xì)胞死亡形式，本質(zhì)是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化過程，與神經(jīng)退行性變、缺血再灌注、癌癥等疾病有關(guān)［13-15］。在正常情況下，胱氨酸的正常運(yùn)輸保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化和抑制鐵死亡［16］。在不同疾病模型的鐵死亡過程中都可以觀測(cè)到線粒體功能受損，活性氧（ROS）增多、膜電位（MMP）改變、脂質(zhì)過氧化加劇和線粒體內(nèi)鐵的積累都證明了這一點(diǎn)［17,18］。然而，對(duì)于目前鐵死亡與線粒體之間的調(diào)控作用與關(guān)系尚不明確［19］。本研究旨在探討HDM誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞是否通過調(diào)控VDAC1引起線粒體功能障礙從而引起鐵死亡，以進(jìn)一步揭示哮喘的發(fā)生機(jī)制并為哮喘的精準(zhǔn)治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

人氣道上皮細(xì)胞株（HBE細(xì)胞，ATCC）；角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（KM培養(yǎng)基，ScienCell）；胎牛血清（GIBCO）；屋塵螨制劑（HDM，ALK-Abello）；VBIT-4（Selleckchem）；線粒體紅色熒光探針（Mito-Tracker Red），Hoechst 33342活細(xì)胞染色液（碧云天）；蘇木素染液，伊紅染液，瑞氏-姬薩姆復(fù)合染液（索萊寶）；免疫組化兔二步法檢測(cè)試劑盒（中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；兔抗VDAC1 單克隆抗體，鼠抗β-acitn 多克隆抗體（Proteintech）；兔抗谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）單克隆抗體（abcam），兔抗鐵蛋白重鏈1（FTH1）多克隆抗體；驢抗兔紅外二抗（Licor）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBE 細(xì)胞使用KM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。HDM濃度梯度刺激分組如下：對(duì)照組；200 U刺激組組：用HDM（800 U/mL）處理24 h；400 U刺激組：用HDM（800 U/mL）處理24 h；800U刺激組組：用HDM（800 U/mL）處理24 h。VBIT-4分組處理如下：對(duì)照組；HDM組：用HDM（800 U/mL）處理24 h；VBIT-4組：用VBIT-4（10 μmol/L）處理24 h；HDM+VBIT-4組：HDM（800 U/mL）與VBIT-4聯(lián)合處理24 h；每天更換KM培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞線粒體膜電位測(cè)定 將HBE細(xì)胞傳代鋪于小皿中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理后加入200μL JC-1染色工作液（1∶200）在37 ℃敷箱避光孵育20 min，PBS清洗后使用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.2.3 線粒體ROS檢測(cè) 將HBE細(xì)胞傳代鋪于小皿中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理后加入200μL JC-1染色工作液（1∶1000，終濃度為5 μmol/L）在37 ℃敷箱避光孵育10 min，PBS清洗后使用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.2.4 Western blot 根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量配適合濃度（10%～15%）的SDS-PAGE膠，以80 V恒壓進(jìn)行電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠的底部（根據(jù)Maker位置），再以300 mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量+30 min公式來計(jì)算，用5%的BSA溶液室溫封閉1 h后，孵育對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液8 h或過夜（兔抗VDAC1濃度為1∶1000，兔抗GPX4濃度1∶1000，兔抗FTH1濃度1∶1000，鼠抗ACTIN濃度為1∶1000），孵育相應(yīng)種屬的二抗（1∶10000）2 h，洗膜后通過Licor Odyssey顯影儀進(jìn)行顯影分析。

1.2.5 哮喘模型構(gòu)建 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠32只，6～8 周齡，體質(zhì)量20～24 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房，將小鼠隨機(jī)分為4組，8只/組：對(duì)照組；VBIT-4組；HDM組；HDM+VBIT-4組。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NFYY-2021-1205）。

1.2.5.1 致敏階段 HDM及HDM+VDAC1組每只小鼠在第0天和第7天通過腹腔腔注射100μL的HDM混合液（4000 U/只，HDM40 μL+PBS60 μL）；對(duì)照組及VBIT-4組注射100μL的PBS磷酸緩沖液。

1.2.5.2 激發(fā)階段 第8天在異氟烷吸入麻醉下，HDM處理組的小鼠每?jī)商觳捎玫伪墙o藥方式給予10μL HDM混懸液（400 U/只，HDM4μL+PBS6μL），總共激發(fā)10 次。HDM+VBIT-4組激發(fā)前進(jìn)行VBIT-4混合液滴鼻（5μg/10μL），最后1次激發(fā)后在24 h內(nèi)處死小鼠進(jìn)行收樣。

1.2.6 肺泡灌洗液計(jì)數(shù) 將收集的肺泡灌洗液充分混勻，吸取10μL混懸液滴加到自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，放入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀內(nèi)，調(diào)整相關(guān)參數(shù)，測(cè)得細(xì)胞總數(shù)后保存數(shù)據(jù)。

1.2.7 H&E染色 取小鼠肺臟組織，4%多聚甲醛固定24 h、石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化后使用蘇木素和伊紅染色后封片。

1.2.8 瑞氏-姬薩姆染色 收集小鼠肺泡灌洗液，重懸后取適量灌洗液滴于載玻片上，固定后使用瑞氏-姬薩姆染液染色后封片，顯微鏡下觀并采集數(shù)據(jù)。

1.2.9 免疫組織化學(xué)染色 取小鼠的肺臟組織，使用4%多聚甲醛固定24 h、石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化后封閉，孵育一抗過夜（GPX-4），在37 ℃下二抗孵育1 h，DAB顯色、改良蘇木素復(fù)染，透明后封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)于計(jì)量數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；均數(shù)滿足方差齊性時(shí)，組間比較采用單向方差分析，組間多重比較采用Bonferroni 法或q檢驗(yàn)；均數(shù)不滿足方差齊性時(shí)，均數(shù)比較采用Welch法，組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn)比較，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)HDM 誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)損傷

在HDM刺激下，與對(duì)照組相比，HBE細(xì)胞mtROS的生成增多（圖1A），同時(shí)JC-1紅光減弱，綠光增強(qiáng)，提示線粒體膜電位下降(圖1B)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在濃度梯度的HDM刺激下，與對(duì)照組相比，當(dāng)HDM濃度到200 U/mL或400 U/mL的濃度時(shí)，VDAC1、GPX4和FTH1的蛋白表達(dá)水平變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C～E）；當(dāng)HDM 濃度達(dá)到800 U/mL時(shí)，VDAC1的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P=0.005）。同時(shí)鐵死亡相關(guān)蛋白FTH1的表達(dá)也上調(diào)（P=0.030），而GPX4則出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（P=0.015）。

圖1 HDM對(duì)HBE細(xì)胞線粒體功能與鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 1 Mitochondrial function and expression of ferroptosis-related proteins in human airway epithelial (HBE) cells exposed to house dust mite (HDM). A: Mitochondrial ROS (mtROS) production assessed by immunofluorescence assay (Original magnification: ×600)and quantitative analysis of fluorescence intensity in each group(n=3).**P＜0.01 vs control group(n=3)B:Mitochondrial membrane potential was assessed by JC-1 staining(×400,n=3).C-E:Expression of GPX4,FTH1 and VDAC1 in the treated cells.*P＜0.05,**P＜0.05 vs control group(n=3).

2.2 使用VDAC1抑制劑VBIT-4可保護(hù)線粒體，抑制HBE細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生

HDM組的出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（圖2），與HDM組相比，HDM+VBIT-4組中，VDAC1的表達(dá)顯著下調(diào)（P=0.001，圖2A），表明VDAC1被抑制，同時(shí)，F(xiàn)TH1的表達(dá)亦顯著下調(diào)（P=0.037，圖2B）而GPX4表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)（P=0.029，圖2C）。免疫熒光提示，在VBIT-4干預(yù)下，與HDM組相比mtROS的生成減少（圖2D），提示線粒體功能得到改善。

圖2 使用VDAC1抑制劑VBIT-4可保護(hù)線粒體，抑制HBE細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生Fig. 2 VBIT-4 protects mitochondria and inhibits ferroptosis in HBE cells.A-C:Protein expressions of VDAC1,GPX4 and FTH1 in the treated cells.*P＜0.05 vs Control group (n=3).#P＜0.05 vs HDM group (n=3).##P＜0.01 vs HDM group (n=3). D: mtROS assessed by immunofluorescence assay(×400)and quantitative analysis of the fluorescence intensity of each group(n=3).

2.3 在HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，VBIT-4抑制氣道炎癥水平

在哮喘小鼠模型中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，相較于對(duì)照組組，HDM組的氣道上皮細(xì)胞中GPX4的免疫組化染色明顯變淺，而使用VBIT-4干預(yù)后，GPX4的免疫組化染色明顯加深（圖4A）。同時(shí)HE染色提示給予VBIT-4處理后，HDM誘導(dǎo)的小鼠模型炎癥水平得到改善（圖3B）而肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)與瑞氏-姬薩姆染色結(jié)果顯示，VBIT-4降低了肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)（P=0.0002）和嗜酸粒細(xì)胞的數(shù)量（P=0.001，圖3C、D）。

圖3 在HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，VBIT-4抑制氣道炎癥水平Fig. 3 VBIT-4 alleviates airway inflammation in mice with HDM-induced asthma.A:Immunohistochemical staining of GPX4 in mouse airway(×400).B:HE staining showing aggregation of inflammatory cells around the airway(×400).C:Total cell counts in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF).*P＜0.05 vs Control group(n=3).#P＜0.05 vs HDM group(n=3).D:Eosinophil counts in the BALF.***P＜0.001 vs Control group(n=3).##P＜0.01 vs HDM group(n=3).

3 討論

目前臨床主要采用糖皮質(zhì)激素或支氣管擴(kuò)張劑緩解哮喘患者的癥狀［20］。但傳統(tǒng)的抗炎藥物會(huì)引起很多不良反應(yīng)，損害人體健康，且近年來越來越多的研究表明，糖皮質(zhì)激素對(duì)不同哮喘表型的治療效果不相同［21］，對(duì)于激素抵抗型哮喘，糖皮質(zhì)激素治療并不能讓患者獲益。因此，我們需要進(jìn)一步研究哮喘發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以開發(fā)最新的治療方案。本研究從體內(nèi)外兩方面探討了鐵死亡在哮喘發(fā)病機(jī)制中的啟動(dòng)機(jī)制，以及可能的調(diào)控機(jī)制。

鐵死亡是細(xì)胞中大量游離鐵的積累導(dǎo)致脂質(zhì)過度氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［22］的過程。谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑，作為GPX4的還原底物發(fā)揮抗氧化作用，從而減少細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物的積累。異胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)受體主要作用是將胱氨酸導(dǎo)入細(xì)胞，還原為半胱氨酸合成GSH，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。當(dāng)細(xì)胞胱氨酸運(yùn)輸受到抑制時(shí)，胞內(nèi)GSH被耗盡，導(dǎo)致GPX4失活，誘發(fā)細(xì)胞死亡。雖然鐵死亡調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，目前仍不明確，但上游通路都是通過各種因素導(dǎo)致的GPX4活性下降，從而可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物還原受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［23］。鐵死亡參與了人類的生物過程和多種人類疾病，但是關(guān)于哮喘發(fā)生鐵死亡的證據(jù)很少。此前有研究報(bào)道，鐵死亡誘導(dǎo)劑（FINs）可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞鐵死亡，GSH可抑制這種細(xì)胞死亡，提示鐵死亡參與了氣道炎癥，抑制鐵死亡可能緩解過敏性氣道炎癥［24］。同時(shí)有報(bào)道稱重度或輕中度哮喘患者肺泡灌洗液中游離鐵的水平降低，與肺功能降低相關(guān)［25］。所以，鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化的細(xì)胞死亡方式，與氧化應(yīng)激高度相關(guān)，線粒體是ROS的主要來源，有研究表明與作用廣泛的抗氧化劑相比，特異性靶向線粒體的抗氧化劑在保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡方面更有效［26］，使用鐵死亡激活劑erastin刺激HT-22和MEF細(xì)胞也能觀察到線粒體ROS 顯著增加［27］，這提示我們線粒體ROS參與鐵死亡發(fā)生的過程。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位降低，mtROS水平升高，這反映了細(xì)胞的氧化損傷［28］。在哮喘小鼠肺組織或HDM刺激的HBE細(xì)胞中，GPX-4的表達(dá)同樣受到抑制，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)主要負(fù)責(zé)鐵儲(chǔ)存的鐵蛋白FTH1的表達(dá)也發(fā)生上調(diào)，有研究表明，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵水平較低時(shí)，自噬體可與FTH1結(jié)合，并將自噬體轉(zhuǎn)移到溶酶體中降解，釋放游離鐵離子［29］，引起細(xì)胞鐵離子增加，F(xiàn)TH1的上調(diào)表明鐵離子的蓄積，為細(xì)胞鐵死亡的啟動(dòng)做準(zhǔn)備。

既往研究表明在腫瘤等［14］疾病中已發(fā)現(xiàn)線粒體損傷與鐵死亡之間存在關(guān)聯(lián)，但具體的調(diào)控機(jī)制仍不明，我們研究發(fā)現(xiàn)HDM刺激的HBE細(xì)胞同樣存在這種關(guān)系，此外VDAC是錨定在線粒體外膜上的通道蛋白，可以轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體與其他組分之間的離子和代謝產(chǎn)物，這提示了VDAC可能與鐵死亡存在關(guān)聯(lián)，VDAC在哺乳動(dòng)物上有三種亞型：VDAC1、VDAC2 和VDAC3，其中VDAC1表達(dá)最廣泛［8］，既往研究指出erastin可能直接與VDAC結(jié)合導(dǎo)致VDAC的構(gòu)象改變，引起線粒體損傷［30,31］，同時(shí)有研究表明鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin可作用于VDAC2 和VDAC3，引起鐵死亡，用siRNA 干 預(yù)VDAC2/3 表達(dá)能抑細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生，但是過表達(dá)VDAC2和VDAC3卻并不能顯著引起erastin誘導(dǎo)下的細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［32］。而我們研究首次發(fā)現(xiàn)，在HDM誘導(dǎo)的體內(nèi)外模型中，VDAC1的表達(dá)都顯著上調(diào)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)增多，嗜酸粒細(xì)胞聚集，而VBIT-4的應(yīng)用緩解了哮喘引起的上述變化，同時(shí)減少了mtROS的積累，恢復(fù)氣道上皮細(xì)胞GPX4的表達(dá)，表明抑制VDAC1減輕了氧化損傷對(duì)哮喘起到保護(hù)作用。但VDAC1在細(xì)胞中充當(dāng)線粒體“看門人”的作用，可調(diào)控線粒體與其他組分之間離子和代謝產(chǎn)物的跨膜交換［33,34］，功能復(fù)雜，有報(bào)道指出，VDAC1有多個(gè)泛素化位點(diǎn)，不同泛素化方式可讓VDAC1執(zhí)行不同的功能［35-37］，因此VDAC1是否直接發(fā)生構(gòu)象改變?cè)斐删€粒體功能障礙，導(dǎo)致鐵死亡從而加重氣道炎癥反應(yīng)仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證了VDAC1參與HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥，并可能通過調(diào)控線粒體功能及鐵死亡發(fā)揮作用。VDAC1可能是哮喘新的靶點(diǎn)，以改善哮喘患者的預(yù)后結(jié)果。