罌粟殼的HPLC指紋圖譜建立及其5個成分的含量測定

張曉萍 石曉峰 張虹艷 朱仁愿 張彩霞

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2755-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.12

摘 要 目的：建立罌粟殼的指紋圖譜，并測定其中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5個成分的含量。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。以Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18為色譜柱，以甲醇-庚烷磺酸鈉溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm（罌粟堿）、216 nm（嗎啡、可待因、那可丁、蒂巴因），柱溫為20 ℃，進樣量為10 ?L。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》建立15批罌粟殼藥材樣品的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，結合混合對照品圖譜確定共有峰;同法測定罌粟殼中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5個成分的含量。采用SPSS 19.0軟件進行聚類分析。結果：15批罌粟殼藥材樣品中共有13個共有峰，相似度均大于0.99;共指認了5個色譜峰，分別為嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁。聚類分析結果顯示，15批罌粟殼藥材樣品可聚為兩類，S1～S7為聚為一類，S8～S15聚為一類，分屬2個地市。嗎啡等5個成分檢測質量濃度的線性范圍分別為10.21～102.10、10.43～104.30、1.54～30.70、2.36～47.28、2.32～57.90 μg/mL（r均大于0.998）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復性試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率分別為99.46%（RSD=1.08%，n=6）、97.84%（RSD=1.55%，n=6）、91.10%（RSD=1.74%，n=6）、96.43%（RSD=1.25%，n=6）、94.82%（RSD=1.20%，n=6）;含量分別為2.342 9～4.082 2、0.430 4～0.889 7、0.055 2～0.090 4、0.299 3～0.558 8、0.343 2～0.656 2 mg/g。結論：所建HPLC指紋圖譜及含量測定方法簡便可行、靈敏準確，結合聚類分析能較好地反映罌粟殼藥材中化學成分的特征及內在質量;雖然不同地市產罌粟殼有區(qū)劃特征，但質量基本穩(wěn)定。

關鍵詞 罌粟殼;指紋圖譜;聚類分析;含量測定;高效液相色譜法

Establishment of HPLC Fingerprint and Content Determination of 5 Components in Papaveris Pericarpium

ZHANG Xiaoping1，SHI Xiaofeng1，2，ZHANG Hongyan1，ZHU Renyuan1，ZHANG Caixia1（1. Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730050， China; 2. Gansu Academy of Medical Sciences， Lanzhou 730050， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Papaveris Pericarpium， and to determine the contents of 5 components， such as morphine， codeine， thebaine， papaverine and narcotine. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on a Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column with mobile phase consisted methanol-sodium heptanesulfonate with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength were set at 238 nm （papaverine） and 216 nm （morphine， codeine， narcotine， thebaine）. The column temperature was 20 ℃， and sample size was 10 ?L. HPLC fingerprints of 15 batches of Papaveris Pericarpium were established by using the Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints （2012 edition）， and the common peaks were determined in combination with the spectra of mixed control. The contents of morphine， codeine， thebaine， papaverine and narcotine were determined simultaneously by the same method. The cluster analysis was conducted by using SPSS 19.0 software. RESULTS： There were 13 common peaks in 15 batches of Papaveris Pericarpium， and the similarity was greater than 0.99. Five chromatographic peaks were identified， which were morphine， codeine， thebaine， papaverine and narcotin. The results of cluster analysis showed that 15 batches of Papaveris Pericarpium could be clustered into two categories， S1-S7 and S8-S15， belonging to two cities. The linear ranges of five components were 10.21-102.10， 10.43-104.30， 1.54-30.70， 2.36-47.28， 2.32-57.90 μg/mL， respectively （all r>0.998）. RSDs of precision， stability （24 h） and repeatability tests were all less than 2%. The average recoveries were 99.46%（RSD=1.08%，n=6）， 97.84%（RSD=1.55%，n=6）， 91.10%（RSD=1.74%，n=6）， 96.43%（RSD=1.25%，n=6）、94.82%（RSD=1.20%，n=6）， respectively. The contents of 5 components were 2.342 9-4.082 2， 0.430 4-0.889 7， 0.055 2-0.090 4， 0.299 3-0.558 8， 0.343 2- 0.656 2 mg/g. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint and content determination method is simple， feasible， sensitive and accurate. It combined with the cluster analysis could reflect characteristics and internal quality of chemical components in Papaveris Pericarpium. Papaveris Pericarpium in different cities possess regionalization characteristics， but its quality is basically stable.

KEYWORDS? ?Papaveris Pericarpium; Fingerprint; Clustering analysis; Content determination; HPLC

罌粟殼，別名米殼、御米殼、粟殼、煙斗斗、煙果果、罌子粟殼等，為罌粟科植物罌粟Papaver somniferum L.的干燥果殼，即于秋季將成熟果實或已割取漿汁后的成熟果實摘下、破開、除去種子和枝梗后所得的干燥果殼，具有斂肺、澀腸、止痛的功效，可用于治療久咳、久泄、脫肛、脘腹疼痛等癥[1]，是國家麻醉藥品目錄中收錄的唯一的中藥飲片[2-3]，主要含有生物堿類、糖類及其衍生物等活性成分[4-5]。生物堿類成分是罌粟殼中的主要成分，包括嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因等30多種成分，占總含量的0.279%～1.133%[6]，其中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因是重要的植物源生物堿，也是鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)咳藥和解痙藥的重要成分[7]。

目前，關于罌粟殼的非法添加和含罌粟殼中成藥中生物堿類成分測定方法的研究較多[8-12]，也有罌粟植株不同部位嗎啡含量和不同等級罌粟殼有效成分含量測定的報道[13-14]。有研究表明，不同的灌水模式及農藥的使用等均會造成罌粟殼中化學成分種類及含量的變化[15-16]，而2020年版《中國藥典》（一部）“罌粟殼”項下僅測定了嗎啡的含量，因此有必要對其指紋圖譜和主要生物堿的含量進行研究。指紋圖譜技術是目前國際公認的中藥制劑質量控制技術，具有整體性、模糊性、特征性等特點，可以充分反映出中藥復雜體系中各個成分的整體情況[17-18]，與化學計量學相結合可以從多個方面綜合評價中藥的質量，已成為科學評價和合理控制中藥質量的有效技術手段[19]?；诖?，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立了罌粟殼的指紋圖譜，同時測定其所含嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5個生物堿類成分的含量，旨在為罌粟殼的質量控制及其科學監(jiān)管提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20A型HPLC儀及配套的二極管陣列檢測器、LabSolution Version 6.83工作站（日本Shimadzu公司），MS105DU型十萬分之一電子天平、ME102/24型萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），IQ7000型超純水機（德國Merck公司），CQ-500B型數控超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），QE-100型粉碎機（浙江屹立工貿有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

嗎啡對照品（批號171201-201324，純度99.1%）、磷酸可待因對照品（批號171203-201306，純度97.5%，以下簡稱“可待因”）、蒂巴因對照品（批號171216-201304，純度100%）、鹽酸罌粟堿對照品（批號171214-201205，純度99.9%，以下簡稱“罌粟堿”）、那可丁對照品（批號171224-201304，純度99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、庚烷磺酸鈉、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

15批罌粟殼藥材樣品（編號S1～S15）為科研用特殊藥品，經甘肅省藥品監(jiān)督管理局批準購自甘肅普安康藥業(yè)有限公司，來源于甘肅農墾集團有限責任公司所轄5個不同農場（FA～FE）。藥材采集時間為2020年6-10月，經蘭州市食品藥品檢驗研究院張彩霞副主任中藥師鑒定為罌粟科植物罌粟 P. somniferum L.的干燥成熟果殼（未割漿）。15批罌粟殼藥材樣品來源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）為色譜柱，以甲醇（A）-庚烷磺酸鈉溶液（B，取庚烷磺酸鈉1.01 g，加水溶解，混勻并稀釋至1 000 mL，用磷酸調節(jié)pH至2.6）為流動相進行梯度洗脫（0～2 min，15%A;2～35 min，15%A→40%A;35～80 min，40%A）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為238 nm（罌粟堿）、216 nm（嗎啡、可待因、那可丁、蒂巴因）;柱溫為20 ℃;進樣量為10 ?L。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取嗎啡對照品10.21 mg、可待因對照品10.43 mg、蒂巴因對照品15.35 mg、罌粟堿對照品11.82 mg、那可丁對照品11.58 mg，分別置于10 mL量瓶中，加20%甲醇（含5%乙酸）溶解并定容，得各單一對照品貯備液。分別精密吸取上述各單一對照品貯備液適量，加20%甲醇（含5%乙酸）稀釋，制成嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁質量濃度分別為40.47、20.34、7.66、11.81、23.14 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取罌粟殼藥材樣品粉末（過50～60目篩，下同），約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加20%甲醇（含5%乙酸）25 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，濾過，藥渣加20%甲醇（含5%乙酸）25 mL同法再提取1次，濾過，合并兩次濾液，蒸干，殘渣用20%甲醇（含5%乙酸）復溶并定容于25 mL量瓶中，經0.45 ?m微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。以嗎啡的色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，13個共有峰相對保留時間的RSD 均小于1.0%（n=6），相對峰面積的RSD 均小于2.0%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取罌粟殼藥材樣品粉末（編號S1）0.5 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以嗎啡的色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，13個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以嗎啡的色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，13個共有峰相對保留時間的RSD 均小于1.0%（n=6），相對峰面積的RSD 均小于2.0%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的建立 精密稱取15批罌粟殼藥材樣品粉末各0.5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行分析，以S1樣品的色譜圖為參照圖譜，以中位數法生成對照圖譜（R），設定時間窗寬度為0.2 s，經多點校正、自動匹配后生成對照指紋圖譜和15 批罌粟殼藥材樣品的疊加指紋圖譜。結果顯示，15批罌粟殼藥材樣品中共有13 個共有峰。15 批罌粟殼藥材樣品的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜見圖1、圖2。

2.1.8 共有峰的指認 經與混合對照品（取“2.1.2”項下混合對照品溶液同法測定所得，圖3A）進行比對，指認5 號峰為嗎啡、6 號峰為可待因、10 號峰為蒂巴因、12號峰為罌粟堿、13號峰為那可丁，保留時間分別為28.086、36.491、55.001、70.744、75.629 min。由于嗎啡為罌粟殼的主要成分，且其色譜峰出峰穩(wěn)定，故選擇其為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，15批罌粟殼藥材共有峰相對保留時間的RSD為0～0.47%，相對峰面積的RSD為0～2.11%。

2.1.9 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行分析，計算15 批罌粟殼藥材樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度。結果顯示，相似度分別為0.997、0.996、0.995、0.993、0.998、0.997、0.999、0.998、0.993、0.996、0.995、0.997、0.996、0.996、0.995，提 示 15 批罌粟殼藥材樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度較高，表明不同地區(qū)產罌粟殼藥材的色譜特征相似，其化學成分組成大致相同、質量穩(wěn)定、差異較小。

2.2 聚類分析

以15批罌粟殼藥材中13個共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件，使用組間聯結法以歐氏平方距離為測度進行聚類分析。結果顯示，15批罌粟殼藥材樣品可聚為兩類，S1～S7為聚為一類，來源于FA、FB、FC農場;S8～S15聚為一類，來源于FD、FE農場。15批罌粟殼藥材樣品的聚類分析樹狀圖見圖4。

2.2 嗎啡等5個成分的含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 溶液的制備 混合對照品溶液的制備同“2.1.2”項，供試品溶液的制備同“2.1.3”項。以20%甲醇（含5%乙酸）為空白溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液（編號S1）、空白溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，在供試品溶液中，嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因的色譜峰保留時間與混合對照品溶液一致，將保留時間一致的色譜峰進行紫外光譜比對，峰純度均大于0.99;各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數以嗎啡計均不低于10 000，空白溶液對測定無干擾。系統(tǒng)適用性試驗的HPLC圖見圖3。

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下嗎啡對照品貯備液50、100、200、250、500 ?L，可待因對照品貯備液50、100、200、250、500 ?L，蒂巴因對照品貯備液5、10、25、50、100 ?L，罌粟堿對照品貯備液10、20、50、100、200 ?L，那可丁對照品貯備液10、20、50、100、250 ?L，置于5 mL量瓶中，用20%甲醇（含5%乙酸）稀釋至刻度，制成系列質量濃度的線性工作溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度（X，?g/mL）為橫坐標、其峰面積的積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁峰面積的RSD分別為0.09%、0.10%、1.80%、0.14%、0.11%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁峰面積的RSD分別為0.10%、0.15%、1.58%、0.98%、0.87%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取罌粟殼藥材樣品粉末（編號S1）0.5 g，共6份，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中各成分的含量。結果顯示，嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的平均含量分別為3.582 5、0.874 8、0.099 5、0. 553 8、0. 559 5 mg/g，RSD分別為0.68%、0.92%、1.25%、0.98%、1.02%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取罌粟殼藥材樣品粉末（編號S1），共6份，每份約0.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入“2.1.2”項下嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁對照品貯備液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的平均加樣回收率為91.10%～99.46%，RSD為1.08%～1.74%（n=6），表明該方法準確度良好。結果見表3。

2.2.9 樣品含量測定 精密稱取15批罌粟殼藥材樣品粉末，每份約0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。每個樣品平行測定3次，結果見表4。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測波長的選擇 有文獻報道，嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁含量測定的檢測波長為250、216 nm[20]。本研究參考上述文獻，采用紫外全波長掃描結合波長切換，分別在250、238、216 nm波長條件下以二極管陣列檢測器進行檢測。結果顯示，嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁的最大吸收波長為216 nm，罌粟堿的最大吸收波長為238 nm，故本研究選擇216 nm為嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁的檢測波長，238 nm為罌粟堿的檢測波長。

3.1.2 流動相的選擇 本課題組前期曾采用Agilent ZORBAX Eclipse C18色譜柱分別考察了以甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液[12]、甲醇-0.1%磷酸溶液[21]、甲醇-0.5%乙酸銨溶液和乙腈-0.5%乙酸銨溶液[22-23]為流動相體系的分離效果，后又采用正向分離系統(tǒng)，使用Venusil HILIC色譜柱考察了以0.1%甲酸溶液-乙腈和10 mmol/L甲酸銨溶液-乙腈[24-26] 為流動相體系的分離效果。結果顯示，上述流動相體系均未取得良好的分離效果。采用甲醇-水為流動相體系，并添加離子對試劑（庚烷磺酸鈉），再用磷酸調節(jié)pH以改善峰形。結果顯示，在“2.1.1”項色譜條件下，嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形對稱、分離良好，相鄰色譜峰分離度均大于1.5。

3.1.3 柱溫的選擇 本課題組前期考察了不同柱溫（20、25、30 ℃）對嗎啡等5個待測成分分離效果的影響。結果顯示，當柱溫為30 ℃時，蒂巴因的色譜峰未能與相鄰色譜峰有效分離;當柱溫為25 ℃時，蒂巴因的色譜峰亦未實現基線分離;而當柱溫為20 ℃時，嗎啡等5個待測成分均能完全分離。

3.2 指紋圖譜和聚類分析結果的探討

本研究建立了罌粟殼藥材的HPLC指紋圖譜，結果顯示，15批罌粟殼藥材樣品中共有13個共有峰;通過與混合對照品比對，指認了其中5個色譜峰，分別為嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿和蒂巴因;樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明15批樣品成分相似。聚類分析結果顯示，15批罌粟殼藥材樣品可聚為兩類，S1～S7聚為一類，S8～S15聚為一類，分屬2個地市。本課題組前期調研發(fā)現，FA、FB、FC等3個農場分布于同一地市，FD、FE農場分布于同一地市，聚類分析結果與產地調研結果一致。

3.3 含量測定結果的分析

本研究對甘肅境內5個不同農場的15批罌粟殼藥材樣品中嗎啡等5個成分的含量進行測定，結果顯示，不同批次罌粟殼中5個成分的含量大小依次為嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因，平均含量分別為3.156 6、0.652 6、0.500 0、0.434 5、0.074 1 mg/g，且不同農場不同批次罌粟殼藥材中嗎啡等5個成分的含量變化趨勢基本一致，即嗎啡含量高的藥材中，其余4個成分的含量也較高。罌粟殼是中藥配方使用和部分中成藥生產的原料，受國家相關部門的嚴格管理，2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定罌粟殼的劑量為每天3～6 g，嗎啡的含量限度為0.06%～0.4%[1]，若患者使用了嗎啡含量較高的罌粟殼則該藥疊加的高含量可待因、罌粟堿等是否會導致成癮性值得研究;此外，雖有部分中成藥設置了嗎啡的含量限度，但若按制劑處方投料嗎啡含量較高的罌粟殼藥材，所得中成藥中嗎啡的含量則極易超標。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜及含量測定方法簡便可行、靈敏準確，結合聚類分析能較好地反映罌粟殼藥材中化學成分的特征及內在質量，雖然不同地市產罌粟殼有區(qū)劃特征，但質量基本穩(wěn)定。

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（收稿日期：2021-06-24 修回日期：2021-09-02）

（編輯：陳 宏）