UHPLC法結(jié)合超濾法測(cè)定連錢草中3種成分的血漿蛋白結(jié)合率

陳偉康 劉德鴻 熊明朋 袁惠 周國(guó)平

中圖分類號(hào) R969.1;R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）22-2720-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.06

摘 要 目的：建立測(cè)定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸血漿蛋白結(jié)合率的方法。方法：采用超高效液相色譜法結(jié)合超濾法測(cè)定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸在新西蘭兔體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率。以Phenomenex Luna? C18為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫為45 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，進(jìn)樣量為3 μL。結(jié)果：在低、中、高質(zhì)量濃度下，迷迭香酸的血漿蛋白結(jié)合率分別為（97.78±1.67）%、（94.32±1.42）%、（95.12±1.51）%（n=3），咖啡酸的血漿蛋白結(jié)合率分別為（90.12±2.33）%、（89.53±1.98）%、（90.23±1.56）%（n=3），綠原酸的血漿蛋白結(jié)合率分別為（63.23±2.12）%、（67.87±1.06）%、（62.34±1.34）%（n=3）。結(jié)論：所建方法操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間較短，可用于測(cè)定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的血漿蛋白結(jié)合率。

關(guān)鍵詞 連錢草;迷迭香酸;咖啡酸;綠原酸;血漿蛋白結(jié)合率;超高效液相色譜;超濾法;兔

Determination of Plasma Protein Binding Rate of 3 Components from Glechoma longituba by UHPLC Combined with Ultrafiltration

CHEN Weikang，LIU Dehong，XIONG Mingpeng，YUAN Hui，ZHOU Guoping（Jiangxi Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Chinese Patent Medicine/Jiangxi Province Engineering Research Center of Drug and Medical Device Quality， Nanchang 330029， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid from Glechoma longituba. METHODS： UHPLC method combined with ultrafiltration method was adopted to determine the plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid from G. longituba in the plasma of New Zealand rabbits. The determination was performed on a Phenomenex Luna? C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （A）-0.1% formic acid solution （B） （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set at 45 ℃， and the detection wavelength was 327 nm. The sample size was 3 μL. RESULTS： At low， medium and high concentrations， the plasma binding rates of rosmarinic acid were （97.78±1.67）%， （94.32±1.42）%， （95.12±1.51）%， respectively （n=3）; those of caffeic acid were （90.12±2.33） %， （89.53±1.98）%，（90.23±1.56）%， respectively （n=3）; those of chlorogenic acid were （63.23±2.12）%， （67.87±1.06）%， （62.34±1.34）%， respectively （n=3）.? CONCLUSIONS： Established method is easy to operate and shorter time for analysis. It can be used to determine the plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid in G. longituba.

KEYWORDS? ?Glechoma longituba; Chlorogenic acid; Caffeic acid; Rosmarinic acid; Plasma protein binding rate; UHPLC; Ultrafitration; Rabbit

連錢草又名活血丹、鈸兒草、佛耳草，為唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr.的干燥地上部分[1]。該藥材具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫的作用，被臨床廣泛用于治療熱淋、石淋、濕熱黃疸、瘡癰腫痛、跌打損傷等癥[2]。現(xiàn)有研究顯示，連錢草的化學(xué)成分眾多，主要包括有機(jī)酸類、黃酮類、萜類和揮發(fā)油類等，其中有機(jī)酸類成分含量以迷迭香酸最高，其次為咖啡酸、綠原酸[3]。上述3種有機(jī)酸類成分具有抗炎、抗病毒、治療膽汁淤積等作用，為連錢草治療肝炎、黃疸的主要成分[4-10]。目前關(guān)于迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的藥理學(xué)研究較多，但同時(shí)測(cè)定三者血漿蛋白結(jié)合率的相關(guān)研究較少。血漿蛋白結(jié)合率是藥物進(jìn)入人體后，與血漿中白蛋白結(jié)合的藥物量占全部藥物總量的百分比，是藥動(dòng)學(xué)的重要參數(shù)之一。藥物與血漿蛋白的結(jié)合將直接影響體內(nèi)游離藥物的濃度，從而影響藥物的吸收、分布、代謝和消除，最終影響其藥效學(xué)行為[11]。本研究擬采用超高效液相色譜（UHPLC）法結(jié)合超濾法測(cè)定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸在新西蘭兔體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率，為闡明該藥材中有效成分的血漿蛋白結(jié)合特性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1290 InfinityTM型UHPLC儀及配備的二元高壓梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、ChemStation C.01.03工作站（美國(guó)Agilent公司），Milli-Q Direct16型超純水儀（美國(guó)Millipore公司），Amicon Ultra-0.5 10K型超濾離心管（截留分子量10 000 Da，德國(guó)Merck公司），Micro 17型臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Vortex WX型渦旋混合器（意大利VELP公司），Transferpette S型微量移液器（德國(guó)Brand公司），BP225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋[國(guó)華（常州）儀器制造有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

連錢草采自江西省九江市，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院周國(guó)平主任中藥師鑒定為唇形科植物活血丹G. longituba（Nakai）Kupr.的干燥地上部分;迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)111871-202007，純度98.1%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-200102，純度>99.9%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-202018，純度96.1%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;甲酸（色譜純）購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為普通級(jí)新西蘭兔，雌雄各半，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg，購(gòu)自贛州市畜牧研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（贛）2018-0009。本研究方案符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)倫理要求。

2 方法

2.1 血漿采集

取新西蘭兔耳動(dòng)脈血，置于肝素鈉一次性采血管中，以1 000×g離心3 min，取上清液，即得血漿，于-18 ℃下冷凍，備用。

2.2 磷酸鹽緩沖液的配制

分別稱取氯化鈉8.00 g、氯化鉀0.20 g、磷酸氫二鈉1.44 g、磷酸二氫鉀0.24 g，置于1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.5%氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7.4，即得磷酸鹽緩沖液（PBS）。

2.3 混合對(duì)照品系列溶液和混合質(zhì)控樣品的配制

分別稱取迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸對(duì)照品各10.0 mg，加70%甲醇溶解并稀釋，制成上述成分質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液適量，加入兔空白血漿超濾液稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為1、3、10、25、50、100、200、300、400 μg/mL的混合對(duì)照品系列溶液。另精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液適量，加入兔空白血漿稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為1、3、50、300 μg/mL的混合質(zhì)控樣品。

2.4 供試品溶液的配制

取連錢草藥材，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，精密稱取粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入PBS 20 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，濾過(guò)，即得連錢草提取液（參考文獻(xiàn)[12]采用高效液相色譜法測(cè)定，迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質(zhì)量濃度分別為261.3、155.3、72.5 μg/mL），作為高質(zhì)量濃度的供試品溶液。精密吸取上述提取液3、4 mL，分別置于5 mL量瓶中，加PBS稀釋至刻度，搖勻，分別作為低、中質(zhì)量濃度的供試品溶液（低質(zhì)量濃度的供試品溶液中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質(zhì)量濃度分別為156.8、93.2、43.5 μg/mL，中質(zhì)量濃度的供試品溶液中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質(zhì)量濃度分別為209.0、124.2、58.0 μg/mL）。

2.5 色譜條件

以Phenomenex Luna? C18（150 mm×2 mm，3 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～1.0 min，5%A;1.0～20.0 min，5%A→21%A）;流速為0.5 mL/min;柱溫為45 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;進(jìn)樣量為3 μL。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液（溶劑為70%甲醇，迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質(zhì)量濃度分別為185.0、224.2、156.0 μg/mL）、“2.7”項(xiàng)下中質(zhì)量濃度供試品+兔血漿的超濾液樣品、PBS+兔血漿的超濾液樣品（即空白樣品）各適量，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸色譜峰的分離度良好，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好。兔血漿中迷迭香酸等3種成分定量分析的超高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6.2 線性關(guān)系和定量下限考察 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品系列溶液，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，分別擬合迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的回歸方程，并以線性范圍下限作為待測(cè)物的定量下限。兔血漿中迷迭香酸等3種成分定量分析的回歸方程、線性范圍和定量下限考察結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下定量下限質(zhì)量濃度（1 μg/mL）以及低、中、高質(zhì)量濃度（3、50、300 μg/mL）的混合質(zhì)控樣品適量，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液按“2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的相對(duì)誤差（RE）來(lái)考察準(zhǔn)確度。兔血漿中迷迭香酸等3種成分定量分析的精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度（3、50、300 μg/mL）的混合質(zhì)控樣品各9份，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液，分別置于4 ℃下冷藏24 h、室溫下放置12 h、反復(fù)凍融（-20～25 ℃）3次后，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，上述條件下迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD均小于10%，表明各混合質(zhì)控樣品在上述條件下的穩(wěn)定性良好。

2.7 血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定

精密吸取“2.4”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度的供試品溶液各200 μL，分別置于2 mL離心管中，加入兔血漿300 μL，渦旋30 s使混合均勻，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，代入隨行回歸方程計(jì)算超濾液中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質(zhì)量濃度，并根據(jù)下列公式計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：血漿蛋白結(jié)合率（%）=（供試品溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度-超濾液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度）/供試品溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度×100%。每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作3份。連錢草中迷迭香酸等3種成分的兔血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸均為酚酸類化合物，其最大吸收波長(zhǎng)分別為329、323、327 nm[13-15]。三者最大吸收波長(zhǎng)相近，經(jīng)本課題組前期研究證實(shí)，無(wú)論選擇上述任意波長(zhǎng)對(duì)3種成分檢測(cè)的靈敏度影響均不大，因綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)在三者中間，因此選擇327 nm作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本課題組前期比較了等度洗脫和梯度洗脫對(duì)迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸色譜峰的影響，結(jié)果顯示，梯度洗脫在分離效果和分析時(shí)間方面均優(yōu)于等度洗脫，故選擇梯度洗脫。此外，本研究采用UHPLC儀，其洗脫梯度變化不宜過(guò)快、分析時(shí)間不宜過(guò)短，因?yàn)橄疵撎荻茸兓^(guò)快或分析時(shí)間過(guò)短可使咖啡酸的色譜峰與其他雜質(zhì)色譜峰重合，大大影響定量分析的準(zhǔn)確性。

本課題組前期比較了不同柱溫（25、35、45 ℃）對(duì)迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸色譜峰分離的影響，結(jié)果顯示，柱溫對(duì)三者色譜峰分離度的影響并不顯著，但當(dāng)柱溫為45 ℃時(shí)，三者的分析時(shí)間明顯縮短且柱壓更低，因此選擇45 ℃作為定量分析的柱溫。

本研究采用德國(guó)Merck公司Amicon Ultra-0.5 10K型超濾離心管，其能在高速離心的狀態(tài)下于較短的時(shí)間（10～30 min）內(nèi)截留分子量大于10 000 Da且與血漿蛋白結(jié)合的化學(xué)成分，而小分子化學(xué)成分則可通過(guò)超濾膜，從而實(shí)現(xiàn)樣品的快速前處理。常用的平衡透析半透膜法則需要12～48 h才能完成小分子成分與大分子成分的分離，同時(shí)還存在操作復(fù)雜、消耗樣品量大、不穩(wěn)定成分易變質(zhì)等不足[16]。與平衡透析半透膜法比較，超濾法分析時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單，因此本研究選擇超濾法作為血漿樣品處理方法。

血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果顯示，連錢草中迷迭香酸、咖啡酸的血漿蛋白結(jié)合率較高（>80%），推測(cè)連錢草與其他藥物聯(lián)用時(shí)，可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合血漿蛋白，抑制其他藥物與血漿蛋白的結(jié)合，使其他藥物在血液中的濃度升高。

綜上所述，本研究所建方法操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間較短，可用于測(cè)定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的血漿蛋白結(jié)合率。

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（收稿日期：2021-07-10 修回日期：2021-10-22）

（編輯：鄒麗娟）