EGFR/AKT/CT-1通路對過氧化氫誘導(dǎo)H9C2細胞凋亡的影響

杜娜 賈桂枝 戴紅良

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 錦州 121001；2生理學(xué)教研室；3社區(qū)護理學(xué)教研室)

氧化應(yīng)激在心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、心房纖顫等眾多心血管疾病的發(fā)病機制中都起著關(guān)鍵性的作用〔1～3〕。氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧(ROS)的過度生成，進而引起心肌細胞的明顯損傷和凋亡〔4〕。因此，深入了解氧化應(yīng)激對心肌細胞凋亡的影響及其潛在機制對于進一步揭示心血管疾病的發(fā)病機制至關(guān)重要。當心肌細胞在受到各種傷害性刺激時，會通過自分泌或旁分泌的形式釋放某些促存活細胞因子，發(fā)揮自我保護作用〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在直接誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的同時，負反饋性地誘導(dǎo)心肌營養(yǎng)素(CT)-1表達的上調(diào)，從而在一定程度上間接緩解了心肌細胞的凋亡〔6〕。本研究探討氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細胞CT-1表達上調(diào)的機制及其對心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、H2O2、AG1478、PP1、GM6001、LY294002(Sigma公司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；CT-1抗體(美國Abcam公司)；蛋白激酶B(AKT)、磷酸化p-AKT抗體(美國Proteintech公司)；AnnexinV-碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒(北京寶賽生物有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、流式細胞儀(美國BD公司)；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及分組 H9C2大鼠心肌細胞系購自中科院上海細胞庫。用含有10% FBS的DMEM，在37℃，5% CO2，飽和濕度下進行常規(guī)培養(yǎng)。用200 μmol/L H2O2處理H9C2細胞15～60 min,分別記為H2O215 min組、H2O230 min組、H2O245 min組、H2O260 min組，以不加H2O2處理作為對照組。細胞先以不同抑制劑預(yù)處理細胞30 min，隨后加入200 μmol/L H2O2繼續(xù)共處理24 h,分別記為對照組、 H2O2組、AG1478+H2O2組、PP1+H2O2組、LY294002+H2O2組。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡分析 細胞用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上充分裂解，得到細胞總蛋白裂解物。將該裂解物于4℃，13 000 r/min下離心5 min，收集上清。用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。等量蛋白質(zhì)采用10%或12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離并轉(zhuǎn)膜后，依次經(jīng)封閉、一抗孵育和二抗孵育后，進行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。

1.4細胞活力MTT法檢測 H9C2細胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理24 h后，加入終濃度為5 μg/μl的MTT溶液20 μl，于37℃，5% CO2，飽和濕度下進行孵育4 h。棄去培養(yǎng)基，后每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液低速振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解。最后于490 nm波長處檢測吸光度值。

1.5細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測 收集各組細胞用0.25%胰酶消化，1 000 r/min，離心5 min收集細胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，避光室溫反應(yīng)15 min，置于流式細胞儀中檢測細胞凋亡情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H2O2對H9C2細胞AKT磷酸化的影響 對照組、H2O215 min組、H2O230 min組、H2O245 min組、H2O260 min組pAKT水平分別為：1.00±0.00、4.19±0.45、6.54±1.24、5.34±1.13、4.13±0.73，H2O2處理各時間點pAKT水平較對照組均顯著增加，30 min時達到峰值。見圖1。

2.2GM6001、AG1478、PP1對H2O2誘導(dǎo)AKT磷酸化的影響 對照組、H2O2組、GM6001+H2O2組、AG1478+H2O2組、PP1+H2O2組pAKT表達水平分別為：1.00±0.00、4.24±0.34、4.57±0.44、1.23±0.11、1.07±0.05。H2O2組、GM6001+H2O2組pAKT表達水平顯著高于對照組，AG1478+H2O2組、PP1+H2O2組pAKT表達水平顯著低于H2O2組(P<0.05)。見圖2。

1～5:對照組、H2O2 15 min組、H2O2 30 min組、H2O2 45 min組、H2O2 60 min組圖1 H2O2對AKT磷酸化的影響

1～5:對照組、H2O2組、GM6001+H2O2組、AG1478+H2O2組、PP1+H2O2組圖2 GM6001、AG1478、PP1對H2O2誘導(dǎo)AKT磷酸化的影響

2.3AG1478、PP1、LY294002對H2O2誘導(dǎo)CT-1上調(diào)的影響 對照組、 H2O2組、AG1478+H2O2組、PP1+H2O2組、LY294002+H2O2組CT-1表達水平分別為：1.00±0.00、2.87±0.17、1.24±0.18、1.25±0.03、1.21±0.04。與對照組相比，H2O2組顯著促進H9C2細胞CT-1的表達，而AG1478、PP1、LY294002預(yù)處理顯著阻止氧化劑誘導(dǎo)CT-1水平上調(diào)。見圖3。

2.4PP1及AG1478對H2O2致H9C2細胞活力降低和凋亡的影響 與對照組相比，H2O2組顯著促進H9C2細胞凋亡，降低細胞活力，而PP1和AG1478預(yù)處理均進一步增強H2O2的細胞損傷作用。流式細胞檢測顯示，PP1和AG1478預(yù)處理可進一步增加H9C2細胞的凋亡。見表1、圖4。

1～5：對照組、H2O2組、AG1478+H2O2組、PP1+H2O2組、LY294002+H2O2 組圖3 AG1478、PP1、LY294002對H2O2誘導(dǎo)CT-1上調(diào)的影響

表1 PP1 和AG1478對H2O2誘導(dǎo)H9C2細胞活力降低的影響

圖4 PP1和AG1478對H2O2誘導(dǎo)H9C2細胞凋亡的影響

3 討 論

CT-1是白細胞介素-6家族的細胞因子，具有促進心肌肥厚和在應(yīng)激環(huán)境下保護心肌的作用〔7〕。在諸如缺血缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激等有害刺激下，外周循環(huán)血中及胚胎期或成年心肌細胞中CT-1水平都出現(xiàn)明顯升高，以緩解各種應(yīng)激刺激對心肌細胞的損傷作用〔5〕。H2O2刺激可顯著提高心肌細胞內(nèi)CT-1的水平，從而限制其對心肌細胞的促凋亡效應(yīng)〔6〕，但目前對于氧化應(yīng)激促進心肌CT-1上調(diào)的分子機理尚缺乏足夠了解。有研究證實，在鼠HL-1心肌細胞系或胚胎干細胞中，缺氧可通過激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)CT-1的過表達〔5，8〕。在本研究中，H9C2心肌細胞經(jīng)H2O2刺激后，AKT出現(xiàn)了迅速和顯著的磷酸化。同時，其特異性抑制劑LY294002預(yù)處理顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的CT-1上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明氧化應(yīng)激對心肌細胞CT-1上調(diào)的效應(yīng)與PI3K/AKT信號通路的活化密切相關(guān)。

EGFR是廣泛表達于各種類型細胞膜上的一種受體酪氨酸激酶，是屬于ErbB受體家族的一個重要成員(其他成員還包括ErbB2、ErbB3、ErbB4)。EGFR與其配體結(jié)合后，發(fā)生同源或異源二聚化，使其發(fā)生自身磷酸化，最終導(dǎo)致酪氨酸激酶活性的激活和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT、磷脂酶(PL)C/蛋白激酶(PK)C等下游信號分子的激活〔9～11〕。例如有研究顯示，EGFR介導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致的AKT磷酸化弱化了硼替佐米促肝癌細胞凋亡效應(yīng)〔12〕。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，EGFR特異性抑制劑AG1478顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的AKT活化，表明H2O2對AKT的活化也是一個EGFR活性依賴的過程。在許多情況下，非受體Src家族酪氨酸激酶與EGFR信號間關(guān)系都極為密切。一方面，Src可作用于EGFR的上游，引起EGFR/Tyr845位發(fā)生磷酸化，使其激酶結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定在活化狀態(tài)，從而激活下游的信號分子〔9，13〕；另一方面，Src也可作為EGFR的下游靶點，激活下游的信號分子〔14〕。在本研究中，Src特異性抑制劑PP1和AG1478 (EGFR特異性抑制劑)均可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的AKT 磷酸化。表明Src和EGFR很可能在同一信號通路上介導(dǎo)H2O2對AKT的激活。至于在本研究背景下，EGFR和Src之間的上下游關(guān)系如何，則尚需進一步確定。雖然在多種刺激和細胞類型中，EGFR的活化依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性。但在本研究中，MMPs特異性抑制劑未能有效抑制H2O2對AKT的激活，表明H2O2對心肌細胞AKT的磷酸化很可能并不依賴于細胞外基質(zhì)或細胞表面的EGF樣因子的參與。

既然H2O2在心肌細胞上引起AKT活化是由EGFR和Src介導(dǎo)的，這兩個分子很可能也像AKT一樣參與了H2O2對CT-1的上調(diào)作用。的確，AG1478(EGFR抑制劑)和PP1(Src抑制劑)均顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的CT-1上調(diào)。與此類似的是，之前有研究顯示在血管平滑肌細胞上也存在EGFR促進CT-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)的現(xiàn)象〔15〕。之前有研究顯示AKT信號可在氧化應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生活化，活化的AKT對氧化應(yīng)激所致的心肌細胞凋亡起著保護性作用〔16〕。我們最近的研究則顯示過氧化氫誘導(dǎo)的CT-1高表達負反饋性地抑制過氧化氫引起的H9C2細胞的凋亡〔6〕。本研究進一步證實PP1和AG1478均顯著惡化過氧化氫對H9C2細胞的損傷作用。上述結(jié)果表明EGFR/AKT/CT-1信號通路活化在氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下對H9C2細胞起著負反饋性的保護作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激可通過活化EGFR/AKT/CT-1信號通路，緩解其對H9C2心肌細胞的直接損傷作用，強化該信號通路有可能對氧化應(yīng)激性心血管疾病產(chǎn)生有益影響。