花姜酮調(diào)控miR-490-3p/Bcl-w誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移、侵襲的機(jī)制

曹斌

(萊蕪市人民醫(yī)院急診科，山東 萊蕪 271100)

肝癌是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一，大部分患者就診時(shí)已處于中晚期，研究表明肝癌細(xì)胞增殖、基質(zhì)黏附及侵襲能力與患者預(yù)后不良密切相關(guān)〔1，2〕。研究表明花姜酮(Zerumbone)可抑制肝癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲〔3，4〕。但關(guān)于Zerumbone對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA(miRNA)在多種腫瘤中異常表達(dá)，并參與腫瘤進(jìn)展，研究表明miR-490-3p在卵巢癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)〔5～7〕。Targetscan預(yù)測(cè)顯示B細(xì)胞淋巴因子(Bcl)-w可能是miR-490-3p的靶基因，Bcl-w在多種腫瘤中發(fā)揮促癌基因作用〔8〕。本研究主要探討Zerumbone對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，并分析其對(duì)miR-490-3p/Bcl-w的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Zerumbone購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司(貨號(hào)：ZPG-83418，規(guī)格：20 mg)；肝癌細(xì)胞Hep3B購(gòu)自上海通派生物科技有限公司。pcDNA3.1購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；MTT購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海朗智生物科技有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白(CyclinD)1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗人Bcl-w抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與SYBR Green試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)處理與分組 Zerumbone溶解于200 μl二甲基亞砜(DMSO)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋為實(shí)驗(yàn)所需濃度7.5 μmol/L、15.0 μmol/L、 30.0 μmol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep3B細(xì)胞，用不同濃度的Zerumbone處理Hep3B細(xì)胞48 h，實(shí)驗(yàn)分組：Zerumbone 0.0 μmol/L組、Zerumbone 7.5 μmol/L組、Zerumbone 15.0 μmol/L組、Zerumbone 30.0 μmol/L組。實(shí)驗(yàn)分組：miR-con組(miR-con轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞)、miR-490-3p組(miR-490-3p mimics轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞)、anti-miR-con組(anti-miR-con轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞)、anti-miR-490-3p組(anti-miR-490-3p轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞)，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行操作。后續(xù)實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證Zerumbone對(duì)miR-490-3p/Bcl-w的調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)分組：miR-490-3p+pcDNA組(miR-490-3p mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞48 h)、miR-490-3p+pcDNA-Bcl-w組(miR-490-3p mimics與pcDNA-Bcl-w共轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞48 h)、Zerumbone+pcDNA組(pcDNA轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞48 h，用含有30 μmol/L的Zerumbone培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h)、Zerumbone+pcDNA-Bcl-w組(pcDNA-Bcl-w轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞48 h，用含有30 μmol/L的Zerumbone培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h)。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep3B細(xì)胞，接種于96孔板(3×104個(gè)/孔)，按照“1.2.1”分組，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，室溫孵育4 h，棄上清，加入150 μl DMSO/孔，混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(OD)，細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep3B細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞遷移：取200 μl Hep3B細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/ml)接種于小室上室，600 μl培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)加入下室，培養(yǎng)24 h，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲：預(yù)冷培養(yǎng)液以9∶1比例稀釋基質(zhì)膠，并鋪于小室上室(40 μl/孔)，其余步驟同細(xì)胞遷移。

1.6qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-490-3p、Bcl-w mRNA表達(dá)水平 取各組Hep3B細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR檢測(cè)miR-490-3p、Bcl-w mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分成4組：WT-Bcl-w+miR-con共轉(zhuǎn)染組、WT-Bcl-w+miR-490-3p mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-Bcl-w+miR-con共轉(zhuǎn)染組、MUT-Bcl-w+miR-490-3p mimics共轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值)。

1.8Western印跡檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3、Bcl-w蛋白表達(dá) 收集各組Hep3B細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白濃度，每組上樣量30 μg，沸水煮10 min，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入CyclinD1(1∶1 000)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)、Cleaved caspase-3(1∶1 000)、Bcl-w(1∶500)一抗稀釋液，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，曝光顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及組間方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布、方差齊性分析的數(shù)據(jù)，采用Kruska-WallisH進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié) 果

2.1Zerumbone抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與Zerumbone 0.0 μmol/L組相比，Zerumbone 7.5 μmol/L組、Zerumbone 15.0 μmol/L組、Zerumbone 30.0 μmol/L組肝癌細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)量降低，細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中Zerumbone 30.0 μmol/L時(shí)作用效果較好，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1、圖2、表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡

1～4：Zerumbone 0.0 μmol/L組、Zerumbone 7.5 μmol/L組、 Zerumbone 15.0 μmol/L組、Zerumbone 30.0 μmol/L組；圖4、圖5同圖2 Western印跡檢測(cè)CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

表1 不同濃度的Zerumbone對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡及遷移、侵襲的影響

2.2Zerumbone抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲 相較于Zerumbone 0.0 μmol/L組，Zerumbone 7.5 μmol/L組、Zerumbone 15.0 μmol/L組、Zerumbone 30.0 μmol/L組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖3、圖4。

圖3 Transwell檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移(結(jié)晶紫，×200)

圖4 Western印跡檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

2.3Zerumbone對(duì)肝癌細(xì)胞miR-490-3p和Bcl-w表達(dá)的影響 與Zerumbone 0.0 μmol/L組相比，Zerumbone 7.5 μmol/L組、Zerumbone 15.0 μmol/L組、Zerumbone 30.0 μmol/L組肝癌細(xì)胞中miR-490-3p表達(dá)水平升高，Bcl-w mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、表2。

圖5 Western印跡檢測(cè)肝癌細(xì)胞Bcl-w蛋白表達(dá)

表2 花姜酮調(diào)控肝癌細(xì)胞miR-490-3p和Bcl-w表達(dá)

2.4miR-490-3p靶向調(diào)控Bcl-w表達(dá) miR-490-3p與Bcl-w存在靶向序列，見圖6。轉(zhuǎn)染克隆有Bcl-w-3′UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-490-3p組熒光素酶活性明顯受到抑制(P<0.05)，見表3。miR-con組、miR-490-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-490-3p組Bcl-w蛋白表達(dá)分別為：0.61±0.04、0.19±0.03、0.55±0.03、0.87±0.09，miR-490-3p組顯著低于miR-con組，anti-miR-490-3p組顯著高于anti-miR-con組(P<0.05)。miR-490-3p可負(fù)向調(diào)控Bcl-w的表達(dá)，見圖7。

圖6 miR-490-3p與Bcl-w存在靶向序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-con組、miR-490-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-490-3p組圖7 Western印跡檢測(cè)肝癌細(xì)胞Bcl-w蛋白表達(dá)

2.5Bcl-w過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-490-3p對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用 與miR-con組相比，miR-490-3p組肝癌細(xì)胞活力、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、Bcl-w、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量降低，細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相較于miR-490-3p+pcDNA組，miR-490-3p+pcDNA-Bcl-w組肝癌細(xì)胞活力、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、Bcl-w、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量升高，細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖8。

表4 Bcl-w過表達(dá)和轉(zhuǎn)染miR-490-3p對(duì)肝癌細(xì)胞存活、遷移、侵襲和細(xì)胞凋亡的影響

1～4：miR-con組、miR-490-3p組、miR-490-3p+pcDNA組、miR-490-3p+pcDNA-Bcl-w組圖8 Western印跡檢測(cè)肝癌細(xì)胞Bcl-w、MMP-2、MMP-9、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.6Bcl-w過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)Zerumbone對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用 與Zerumbone+pcDNA組比較，Zerumbone+pcDNA-Bcl-w組肝癌細(xì)胞活力、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、Bcl-w、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量升高，細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，見表5、圖9。

表5 Bcl-w過表達(dá)和Zerumbone處理對(duì)肝癌細(xì)胞存活、遷移、侵襲和細(xì)胞凋亡的影響

1～4：NC組、Zerumbone組、Zerumbone+pcDNA組、Zerumbone+pcDNA-Bcl-w組圖9 Western印跡檢測(cè)肝癌細(xì)胞Bcl-w、MMP-2、MMP-9、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

肝癌是臨床常見消化道惡性腫瘤之一，近年來，肝癌發(fā)病率逐年上升，由于肝癌惡性程度高及發(fā)展迅速導(dǎo)致患者預(yù)后較差，臨床常采用手術(shù)與化療等方法進(jìn)行治療，但患者易產(chǎn)生不良反應(yīng)。研究表明部分中藥在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用，并可通過調(diào)控癌細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔9，10〕。因此，本研究主要探究Zerumbone在肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用Zerumbone提供參考依據(jù)。

Zerumbone是從球姜中提取的化合物，其具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用，研究表明Zerumbone可通過上調(diào)Bax的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡〔11〕。研究報(bào)道指出Zerumbone還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯從而增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性〔12〕。Zerumbone還可通過抑制黏著斑激酶(FAK)/蛋白激酶B(AKT)/Rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(ROCK)信號(hào)通路的激活從而抑制肺癌細(xì)胞侵襲〔13〕。本研究結(jié)果顯示Zerumbone可顯著降低肝癌細(xì)胞活力，增加細(xì)胞凋亡率，提示Zerumbone可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。研究表明CyclinD1可正向調(diào)控肝癌細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，caspase-3激活可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14，15〕。本研究結(jié)果顯示Zerumbone可抑制CyclinD1的表達(dá)，Zerumbone可上調(diào)Cleaved caspase-3的表達(dá)。MMP-2、MMP-9可促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移〔16〕。本研究結(jié)果提示Zerumbone可抑制肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。miR-490-3p可能通過調(diào)控Smad2表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲〔17〕。研究表明miR-490-3p可通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體(TGFβR)1的表達(dá)從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔18〕。Bcl-w在甲狀腺乳頭癌組織中呈高表達(dá)，miR-133b可能通過負(fù)調(diào)控Bcl-w表達(dá)抑制甲狀腺乳頭癌細(xì)胞增殖及侵襲〔19〕。miR-203可能通過抑制Bcl-w的表達(dá)從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡〔20〕。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bcl-w是miR-490-3p的靶基因，miR-490-3p可靶向調(diào)控Bcl-w的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，Bcl-w過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-490-3p過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用，Zerumbone可通過上調(diào)miR-490-3p及下調(diào)Bcl-w來抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Zerumbone可通過調(diào)控miR-490-3p/Bcl-w抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，闡述Zerumbone抗肝癌作用的部分作用機(jī)理，控制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能是Zerumbone發(fā)揮抗肝癌作用的重要機(jī)制之一，為Zerumbone應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。