健脾固腎化瘀湯對(duì)糖尿病腎病大鼠CTGF及podocin的影響

呂樹泉 張淑芳 王元松 蘇秀海

(河北中醫(yī)學(xué)院附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病科，河北 滄州 061001)

糖尿病腎病是糖尿病臨床上常見的并發(fā)癥之一，其主要特征表現(xiàn)為腎小球肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化等，糖尿病腎病是導(dǎo)致腎衰竭的重要原因〔1〕。有研究表明，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與多種細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激等因素有關(guān)。臨床上通常以藥物進(jìn)行治療，西藥起效快，但西藥會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的損傷〔2〕。中藥歷史悠久，對(duì)于糖尿病腎病的治療有重要意義，有學(xué)者認(rèn)為，健脾固腎化瘀湯有降低血清三酰甘油、總膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、α-金屬硫蛋白(MT)-1、α-肌動(dòng)蛋白(SMA)、微管輕鏈Ⅰ蛋白3-Ⅱ型(LC3-Ⅱ)、Beclin等指標(biāo)水平的作用,對(duì)腎組織病理改變有改善和保護(hù)作用〔3〕。因此本研究運(yùn)用健脾固腎化瘀湯對(duì)糖尿病腎病大鼠進(jìn)行治療，為臨床上健脾固腎化瘀湯的應(yīng)用提供了新的循證參考。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選取SPF級(jí)60只SD健康大鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：11401300065459，單位許可證號(hào)：SYXK(津)2014-0002，鼠齡(3.9±0.3)個(gè)月，體重(227.7±10.8)g。所有大鼠養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1 w。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：健脾固腎化瘀湯(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)；大鼠抗小鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1 mRNA抗體(北京百奧萊博科技有限公司)；兔抗小鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)抗體、C-C型趨化因子配體(CCL)5 試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)；人抗大鼠腎小球足細(xì)胞裂隙膜蛋白(podocin)抗體(廈門研科生物技術(shù)有限公司)；大鼠抗兔腎小球足細(xì)胞nephin mRNA抗體及兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抗體(上海科敏生物科技有限公司)；超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組、建模及給藥 隨機(jī)選取60只大鼠中10只作為正常組，剩余50只大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)〔4〕誘導(dǎo)建立糖尿病腎病大鼠模型，造模前，所有大鼠禁食12 h，腹腔一次性注射STZ(65 mg/kg)，STZ使用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH=4.5)進(jìn)行配制，須在10 min內(nèi)使用完；72 h后，取尾靜脈血測(cè)空腹血糖(FPG)，連續(xù)3次，取其平均值，當(dāng)FPG>16.7 mmol/L提示造模成功，成功率為70%，去除未成功建模大鼠。建模成功后，均在12 h后開始給藥，雷米普利組使用雷米普利片進(jìn)行灌胃，0.001 g/kg，1次/d；健脾固腎化瘀湯是由黃芪、西洋參、白術(shù)、山藥、芡實(shí)、金櫻子、山茱萸、熟地黃、當(dāng)歸、丹參、水蛭、茯苓、酒大黃組成，按比例加入純凈水制成混懸液，然后對(duì)低、中、高劑量組進(jìn)行灌胃處理，1次/d，使用劑量分別為：1.9 g/kg、3.8 g/kg、7.6 g/kg；正常組與模型組以同等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)8 w。

1.2.2樣本采集 所有大鼠在給藥8 w后，靜脈采血后處死，離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存，待用。

1.2.3切片及染色 取腎臟組織，4%多聚甲醛固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色，之后脫水、透明，切片厚度為4 μm，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.2.4生物化學(xué)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)尿素、肌酐、三酰甘油、總膽固醇進(jìn)行檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)24 h尿蛋白進(jìn)行檢測(cè)，取50 mmol/L碳酸鹽緩沖液對(duì)24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP進(jìn)行稀釋，加入聚苯乙烯的反應(yīng)孔中，加蓋處理后，在4℃下置留24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4，0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋待測(cè)標(biāo)本0.1 ml，加入陽(yáng)性、陰性對(duì)照標(biāo)本，在42℃下置留60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP抗體0.1 ml，再次置留60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸)混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔內(nèi)，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450，分析24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP水平。采用羅氏Accu-Chck血糖檢測(cè)儀對(duì)FPG進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)檢測(cè) RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說明書進(jìn)行。依次加入2.5 μl稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl上游引物和下游引物，最后加水配成總體積25 μl的反應(yīng)體系。94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，重復(fù)最少3次。采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測(cè)的IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)水平。IGF-1 mRNA引物序列：上游cDNA 為模板、GAPDH 為內(nèi)參照，用以下引物(上游:5′-CCAGTCACATCCTCCTCG-3′；下游：5′-TACATCTCCAGCCTCCTCA-3′)；nephrin mRNA引物序列：上游cDNA 為模板、GAPDH 為內(nèi)參照，用以下引物(上游:5′-CCCTGCCTCTGTCTTCTCTG-3′；下游：5′-GGTGGTCTTCTGCTGCTCTC-3′)。

1.2.6CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) 使用免疫組化染色對(duì)CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，將二甲苯更換放置10 min后進(jìn)行酒精水化，加入蛋白酶修復(fù)液，進(jìn)行孵化30 min，溫度為：37℃，棄抗原；將切片移至濕盒中，加入3%H2O2，恒溫冰箱孵育10 min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗；再次加入山羊血清，常溫下封閉30 min，使用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，再次加入二抗，孵育1 h，進(jìn)行PBS沖洗，經(jīng)過二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色處理10 min，觀察棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)，采用PBS沖洗1 min；使用蘇木素染色3 min，使用濃度為1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化處理，使用自來水沖洗1 min，脫水、封片處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 與正常組相比，模型組腎小球血管壁狹窄，腎小球上皮細(xì)胞變性，腎小管周圍明顯炎癥侵蝕；雷米普利組腎小管血管壁有所改善，仍伴有炎性細(xì)胞；低、中、高劑量組腎組織明顯改善，且高劑量組最為明顯。見圖1。

圖1 各組腎組織病理組織學(xué)觀察(HE，×400)

2.2各組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平比較 與正常組相比，其余各組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平均顯著降低(P<0.05)；與雷米普利組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1。

表1 各組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平比較

2.3各組FPG、CCL5、hs-CRP水平比較 與正常組相比，其余各組FPG、CCL5、hs-CRP水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組FPG、CCL5、hs-CRP水平均顯著降低(P<0.05)；與雷米普利組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組FPG、CCL5、hs-CRP水平均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表2。

表2 各組FPG、CCL5、hs-CRP水平比較

2.4各組腎皮質(zhì)IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)水平比較 與正常組相比，其余各組IGF-1 mRNA水平顯著升高，而nephrin mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IGF-1 mRNA水平顯著降低，而nephrin mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與雷米普利組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組IGF-1 mRNA水平均顯著降低，而nephrin mRNA水平均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖2，表3。

1～6：正常組，模型組，雷米普利組，低劑量組，中劑量組，高劑量組圖2 RT-PCR檢測(cè)各組IGF-1 mRNA、nephrin mRNA的表達(dá)

表3 各組腎皮質(zhì)IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)水平比較

2.5各組CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 與正常組相比，其余各組CTGF、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高，而podocin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CTGF、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低，而podocin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與雷米普利組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組CTGF、NF-κB蛋白水平顯著降低，而podocin蛋白水平顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 各組腎組織中CTGF、podocin、NF-κB免疫組化染色(DAB，×400)

表4 各組CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

糖尿病腎病是導(dǎo)致腎衰竭的主要原因之一，其病情隱匿，早期無(wú)明顯癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)，已進(jìn)入臨床期，主要表現(xiàn)為蛋白尿、漸進(jìn)性腎功能損害、高血壓、等病理特征〔5〕。其發(fā)病機(jī)制尚不明確。中醫(yī)上將其歸為“水腫”“尿濁”等范疇，遷延日久，導(dǎo)致陰陽(yáng)兩虛，脾腎衰弱〔6〕。早期糖尿病腎病病位在脾，脾氣虧虛，機(jī)體失養(yǎng)則疲倦乏力，脾虛日久，后天失養(yǎng)，累及先天，腎氣虧虛則小便短少，或夜尿頻多；脾腎氣虛，固攝失權(quán)，精微漏出，則尿濁〔7〕。

健脾固腎化瘀湯重用黃芪，味苦甘，性微溫，益氣健脾，消腫利尿，補(bǔ)諸虛不足，補(bǔ)齊力強(qiáng)且能生陽(yáng)；西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰；熟地黃、山茱萸、山藥均有補(bǔ)虛益腎之用；芡實(shí)、金櫻子、五味子固精益腎；白術(shù)益氣健脾，茯苓利水淡滲，兩者合用，能夠利水濕從小便去；當(dāng)歸養(yǎng)血活血；丹參、酒大黃、水蛭能活血化瘀〔8〕。全方諸藥使用，標(biāo)本兼顧，共奏健脾固腎、化瘀通絡(luò)之功。

FPG主要用于檢測(cè)血糖濃度〔9〕。CCL5是一種分泌性蛋白，屬于CC家族中的一員，且參與調(diào)節(jié)免疫的過程。CCL5在多個(gè)細(xì)胞中均有表達(dá)，其中包括脂肪細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞、血小板等〔10〕。hs-CRP是一種急性相反應(yīng)蛋白，主要通過肝細(xì)胞分泌，并且受多種炎性因子的調(diào)控和誘導(dǎo)〔11〕。有研究表明，hs-CRP炎性反應(yīng)時(shí)，可通過促進(jìn)尿蛋白漏出增加糖尿病腎病的發(fā)生。hs-CRP不僅能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，還是炎癥反應(yīng)的重要生化指標(biāo)〔13〕。本研究結(jié)果說明健脾固腎化瘀湯可一定程度減輕糖尿病腎病大鼠炎性因子水平，降低血糖，且呈劑量依賴。

IGF-1能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且能促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖等。研究表明IGF-1是一種有代謝效應(yīng)的細(xì)胞因子，并且在生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用〔14,15〕。在糖尿病腎病中，高血糖致使細(xì)胞嚴(yán)重缺氧損傷，導(dǎo)致腎臟局部IGF-1旁分泌增高，降解減少，從而導(dǎo)致IGF-1水平升高。IGF-1還能通過誘導(dǎo)腎臟激肽釋放酶激活，致使腎小球血流改變。nephrin屬于腎小球的濾過屏障，其一共分為3層，是最早發(fā)現(xiàn)的一種裂孔隔膜蛋白，能維持關(guān)鍵裂空隔膜蛋白分子，是檢測(cè)腎小球損傷的重要標(biāo)志物〔16，17〕。本研究結(jié)果說明健脾固腎化瘀湯在一定程度上可改善糖尿病腎病大鼠IGF-1、nephrin的表達(dá)，效果顯著，且呈劑量依賴。

CTGF廣泛存在于體內(nèi)，在各個(gè)器官和細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，但廣泛存在于腎組織中，生理狀態(tài)下，腎小球分泌較少的CTGF，但在機(jī)體出現(xiàn)纖維化時(shí)，其水平會(huì)顯著升高〔18〕。CTGF能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成纖維細(xì)胞的聚集等，促進(jìn)膠原和黏蛋白的合成。podocin是一種跨膜蛋白，是Sto-matin家族的一員，主要存在于腎組織中〔19〕。NF-κB是一種與炎癥作用產(chǎn)生、細(xì)胞增生和細(xì)胞凋亡等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB的活化能夠使細(xì)胞因子和外基質(zhì)上調(diào)。NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)綠因子，是由p50和p65兩個(gè)多肽鏈組成。當(dāng)細(xì)胞靜息條件下，其處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IκB與NF-κB迅速分離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與基因轉(zhuǎn)錄，因此在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用〔20〕。本研究結(jié)果說明健脾固腎化瘀湯可在一定程度上改善糖尿病腎病大鼠CTGF、podocin、NF-κB表達(dá)，效果顯著，且呈劑量依賴。

綜上，健脾固腎化瘀湯有降低尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白定量、CCL5、hs-CRP等水平的作用，對(duì)腎組織病理改變有改善和保護(hù)作用。