姜黃素基于IL-8/MUC5ac信號通路對慢性阻塞性肺疾病大鼠的干預效果

周芳 陳林 蔡佳 譚小武 曾賽麗 賈遠航

(南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001)

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一種常見的肺部疾病，其主要特征為氣流受限，并伴有氣道和肺對有害氣體所致的慢性炎癥，呈現(xiàn)出不完全可逆、進行性受阻等特性。近年來，隨著生活水平的不斷提高，有害氣體的增加，使其患病率逐年增加，造成嚴重的經(jīng)濟和社會負擔〔1,2〕。有研究表明，病原微生物是導致慢阻肺主要原因之一，可直接導致肺損傷和呼吸黏膜受損〔3〕。但目前臨床上慢阻肺的治療效果并不理想，姜黃素屬于一種多酚類物質(zhì)，主要從姜黃根莖中提取獲得，其具有較強的抗炎作用，并且其安全性較高，還原性較強〔4〕。有研究認為，其能夠改善糖皮質(zhì)激素抵抗〔5〕。但目前臨床上對于姜黃素治療慢阻肺機制并不明確，因此本研究探討姜黃素治療慢阻肺大鼠的療效，為臨床上姜黃素的應用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取SPF級40只SD健康大鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，鼠齡(3.5±0.2)個月，體重(219.7±8.5)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間1 w。本研究所做實驗獲南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準。

主要試劑：姜黃素(河北天旭生物科技有限公司)；鹽酸氨溴索(湘潭嘉葉源生物科技有限公司)；兔抗大鼠MUC5AC抗體(上海瑤韻生物科技有限公司)；大鼠抗小鼠白細胞介素(IL)-8抗體(天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠MUC5B抗體(上海士鋒生物科技有限公司)；人抗大鼠NE抗體(上海恪敏生物科技有限公司)；兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-α抗體(上海撫生實業(yè)有限公司)小鼠抗大鼠表皮生長因子受體(EGFR)抗體(武漢艾美捷科技有限公司)；外源性白三烯(LT)B4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)肺表面活性蛋白(SP)-D ELISA試劑盒(天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9 ELISA試劑盒、MMP-2 ELISA試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組、建模及給藥 隨機選取40只大鼠中10只作為正常組，其余大鼠參照鐘蓮娣等〔6〕方法建立慢阻肺模型，在實驗1～15 d時使用2%的戊巴比妥溶液對大鼠進行麻醉，劑量50 mg/kg，在無菌的條件下進行頸中切口并分離氣管，使用頭皮針進行穿刺，氣管內(nèi)滴注1 g/L的LPS溶液2 mg/kg，注射后，對大鼠進行直立旋轉(zhuǎn)2 min，使肺內(nèi)藥物分布均勻，縫合后正常飼養(yǎng)，該日不予煙熏。陽性對照組使用劑量為30 mg鹽酸氨溴索皮下注射，2次/d；姜黃素組使用劑量為200 mg/kg姜黃素進行灌胃處理，1次/d；正常組和模型組不做任何處理。

1.2.2切片及染色 在給藥干預1 w后隨機選取各組中1只大鼠采用斷頭法處死，取肺組織，在含有4%的甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片、脫水，進行HE染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.3樣本采集 抽取五組剩余9只大鼠頸總動脈血3 ml，在抗凝管中保存，用3 000 r/min的離心機離心，10 min后，將離心靜脈血滴入EP試管中，分離上層血清，在-80℃環(huán)境下保存，待用。

1.2.4肺功能檢測 將大鼠麻醉后，分離暴露氣管，并在氣管軟骨處做環(huán)形切口，接入三通管，將氣管和三通管固定后，使用RSE3020動物肺功能檢測儀對用力肺活量(FVC)、呼氣峰值流速(PEF)、第1秒用力呼氣量進行檢測。

1.2.5肺泡灌洗液白細胞數(shù)目及分類統(tǒng)計 待肺功能完成后，將三通管去除后，切開胸部，對右肺門進行結(jié)扎處理，將5 ml的生理鹽水注入左肺中，進行3次沖洗，進行回收，并離心棄上清，加入200 μl PBS，進行細胞沉淀，震蕩均勻后，取20 μl，在顯微鏡下對細胞總數(shù)進行計算。剩余細胞液制備細胞涂片，待干后進行染色，并在顯微鏡下對200個細胞中巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)目進行統(tǒng)計，計算其比率。

1.2.6LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平檢測 采用ELISA對LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平進行檢測。

1.2.7IL-8/MUC5ac通路蛋白檢測 Western印跡檢測IL-8/MUC5ac通路中MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR通路蛋白，提取大鼠肺組織中的樣品總蛋白，將其與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，進行電泳，并將蛋白電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR按照1∶1 000稀釋)，在4℃條件下進行震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR按照1∶5 000稀釋)，室內(nèi)震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學觀察 正常組肺泡、纖毛形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整；模型組上皮細胞大量脫落，肺泡壁變薄并破裂；陽性對照組上皮細胞部分脫落，肺泡壁變薄；姜黃素組上皮細胞脫落不明顯，肺泡融合。見圖1。

圖1 各組肺組織病理形態(tài)學(HE，×200)

2.2各組肺功能比較 如表1所示，模型組、陽性對照組、姜黃素組FVC、PEF、FEV1均低于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組FVC、PEF、FEV1均高于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；姜黃素組FVC、PEF、 FEV1均高于陽性對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 各組肺功能比較

2.3各組肺泡灌洗液白細胞數(shù)目及分類比較 如表2所示，模型組、陽性對照組、姜黃素組白細胞數(shù)、中性粒細胞比率高于正常組，且巨噬細胞、淋巴細胞比率低于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組白細胞數(shù)、中性粒細胞比率低于模型組，且巨噬細胞、淋巴細胞比率高于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；姜黃素組白細胞數(shù)、中性粒細胞比率低于陽性對照組，且巨噬細胞、淋巴細胞比率高于陽性對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表2 各組肺泡灌洗液白細胞數(shù)目及分類、血清中LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平比較

2.4各組血清中LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平比較 模型組、陽性對照組、姜黃素組LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均高于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均低于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；姜黃素組LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均低于陽性對照組(P<0.05)。見表2。

2.5各組肺組織中IL-8/MUC5ac信號通路蛋白表達量比較 如圖2、表3所示，模型組、陽性對照組、姜黃素組MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量均高于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量均低于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；姜黃素組MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量均低于陽性對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖2 各組肺組織中IL-8/MUC5ac通路蛋白MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達

表3 各組肺組織中IL-8/MUC5ac信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

慢阻肺屬于一種慢性氣道炎癥疾病，其可導致黏液分泌增加，而致使炎癥加重。慢阻肺其特點為不完全可逆、呈進行性發(fā)展等，其與肺部有害氣體和有害顆粒有關〔7〕。慢阻肺主要是由氣道、肺血管等發(fā)生炎癥病變而導致，當肺部中的肺泡巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞等聚集時，會導致氣道病變，并促使肺損傷。趙春柳等〔8〕研究認為,呼吸道病毒感染在慢阻肺急性加重期常見，發(fā)熱是常見癥狀；穩(wěn)定期呼吸道癥狀嚴重者對病毒易感，呼吸道病毒感染導致系統(tǒng)性炎癥水平升高，流感病毒顯著。

姜黃素具有較好的抗炎、抗氧化、抗癌等功能，屬于一種多效天然物質(zhì)。其能夠通過抑制脂肪氧化酶、腫瘤壞死因子等發(fā)揮其療效，能夠改善關節(jié)炎、心肌炎等多種炎性疾病〔9〕。姜黃素能夠通過抗氧化而清除自由基、抗炎性反應、調(diào)脂等，起到防止動脈粥樣硬化作用。欒春雨等〔10〕研究中認為，姜黃素和布地奈德合用大鼠肺組織中IL-8、TNF-α、MMP-9等的表達量明顯降低，并與HDAC2的表達量呈負相關，這種相關性可能與大鼠肺組織的IL-8、MCP-1、TNF-α、MMP-9啟動子區(qū)與HDAC2的結(jié)合水平有關。說明姜黃素可能通過升高HDAC2的表達量和活性,增強慢阻肺大鼠對糖皮質(zhì)激素的敏感性及抗炎作用。因此本研究中，建立慢阻肺模型大鼠進行治療，結(jié)果顯示，模型組大鼠肺功能低于正常組，陽性對照組和姜黃素組大鼠肺功能高于模型組，且姜黃素組大鼠肺功能高于陽性對照組，此結(jié)果說明，姜黃素可有效改善肺功能，效果顯著。

LTB4屬于花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，在炎性刺激下，各類炎癥細胞均可產(chǎn)生LTB4。有研究表明，其能夠通過巨噬細胞和嗜酸性粒細胞等釋放，并參與慢阻肺等氣道炎癥過程，均有較強的炎癥作用〔11〕。SP-D屬于一種促炎性因子，當機體受到炎癥侵襲時，其水平顯著提高。劉海平等〔12〕研究認為，呼出氣冷凝液(EBC)和血清中SP-D、趨化因子(CCL)18表達變化在慢阻肺急性加重病情監(jiān)測中具有一定價值，而且EBC中SP-D、CCL18表達變化在慢阻肺急性加重患者病情監(jiān)測中更具獨特的優(yōu)勢。MMP-2和MMP-9均屬于MMP家族中的一員，MMP屬于蛋白水解酶的一種，在慢阻肺的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，當MMP表達過多時，會直接導致肺部炎癥和肺實質(zhì)損傷〔13,14〕。本研究結(jié)果說明，姜黃素可有效改善慢阻肺大鼠炎癥水平，效果顯著。

IL-8能夠通過與氣道表面IL-8受體結(jié)合，趨化氣道表面細胞，活化MUC5AC黏蛋白，促發(fā)炎癥。MUC5AC是由氣道杯狀細胞和黏膜下腺分泌，主要存在于氣道表面上皮細胞層，能夠被各種因素所影響，是人類呼吸道分泌較多且緊密相關的黏蛋白〔15〕。IL-8屬于多源性細胞因子，能夠促進炎癥反應，是一種重要的炎癥介質(zhì)，有研究表明，其可在TGF-α和IL-1的誘導下釋放〔16〕。MUC5B屬于黏蛋白的一種，主要產(chǎn)生于呼吸道〔17〕。NE也稱為中性粒細胞彈性蛋白酶，其能夠聚集炎癥因子，且能夠加速氣道的破壞和肺組織的損傷〔18〕。TGF-α在細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，并且在細胞外基質(zhì)中起到抑制和沉淀的作用，有研究表明，TGF-α能夠通過抑制蛋白水解酶、膠原酶原等起到降解細胞外基質(zhì)的表達〔19〕。EGFR屬于ErbB家族中的一員，主要存在于上皮細胞、成纖維細胞等細胞表面，屬于酪氨酸激酶型受體〔20〕。本研究結(jié)果說明，姜黃素可有效改善慢阻肺大鼠肺組織MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量，效果顯著。

綜上所述，姜黃素能明顯改善慢阻肺大鼠肺損傷程度，降低炎癥水平，其機制可能與IL-8/MUC5ac通路受到抑制有關，為臨床上治療慢阻肺等其他炎癥病癥提供了新的方向。