清化逆萎湯治療萎縮性胃炎伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變臨床觀察及對(duì)PTEN、AKT表達(dá)的影響?

王麗華，張永強(qiáng)

(東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院，江蘇 江陰 214400)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophy gastritis，CAG)伴腸上皮化生(intestinal metaplasia，IM)和(或)異型增生(dysplasia，Dys)屬于胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)。其中，胃黏膜輕、中度異型增生統(tǒng)稱為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變[1](low grade intrapithelial neoplasia，LGIN)。從正常胃黏膜發(fā)展至最終形成胃癌，經(jīng)歷了“正常胃黏膜→萎縮→腸化→異型增生(上皮內(nèi)瘤變)→胃癌”[2]的過程。在這一過程中，幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)感染扮演著重要角色，其與胃癌的關(guān)系極為密切[3]。研究指出，根除Hp可在一定程度上減緩癌前病變的進(jìn)展，減少胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)[4]，但同時(shí)也認(rèn)為，最佳的干預(yù)時(shí)間僅僅是在胃癌前病變發(fā)生之前[5，6]。因此，對(duì)于既已出現(xiàn)胃癌前病變者，如何阻止和逆轉(zhuǎn)上述這一過程，可以說是胃癌防治的重點(diǎn)與難點(diǎn)。相較西醫(yī)而言，中醫(yī)在治療CAG伴LGIN方面具有一定優(yōu)勢(shì)，不論是對(duì)癥狀的改善、對(duì)胃黏膜的修復(fù)，還是對(duì)上皮內(nèi)瘤變的抑制甚至逆轉(zhuǎn)，均顯示出較為可觀的療效。為進(jìn)一步說明，本研究臨床隨機(jī)篩選出經(jīng)胃鏡、病理確診CAG伴LGIN且符合Hp陰性或經(jīng)正規(guī)四聯(lián)療法治療后轉(zhuǎn)陰的患者共66例，通過對(duì)比治療前后臨床癥狀、胃鏡、病理等各方面情況，以評(píng)估清化逆萎湯(自擬方)的臨床療效。同時(shí)，從免疫組化方面觀察清化逆萎湯對(duì)PTEN(phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten)、AKT(a serine/threonine protein kinase)表達(dá)的影響，以探討其可能的作用機(jī)理。本研究已獲得東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理學(xué)批準(zhǔn)號(hào)[2017]倫審研第(025)號(hào)，患者及家屬簽署知情同意書。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院中西結(jié)合消化科門診66例患者，采用單盲平行隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，分A、B、C 3組各22例。其中A組男15例，女7例，平均年齡(57.73±8.92)歲；B組男17例，女5例，平均年齡(58.05±9.83)歲；C組男14例，女8例，平均年齡(55.05±9.05)歲。3組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照世界衛(wèi)生組織WHO Classification of tumors of the digestive system(2010 年)及《2017中國慢性胃炎共識(shí)意見》[6]，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照我國慢性胃炎的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)和新悉尼系統(tǒng)的直觀模擬評(píng)分法(visualanaloguescale)制定[6]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合慢性萎縮性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(輕、中度異型增生)；Hp陰性；若病理和(或)13C-UBT檢測(cè)提示陽性，需經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)四聯(lián)療法[7](雷貝拉唑10 mg+阿莫西林1.0+克拉霉素0.5+枸櫞酸鉍鉀 0.6，每日2次，口服)治療14 d，停藥1個(gè)月后復(fù)查13C-UBT(呼氣試驗(yàn))，提示HP陰性者，方可納入試驗(yàn)；受試者年齡18歲至70歲之間；知情同意并簽署相關(guān)文件。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

合并消化性潰瘍、病理提示重度異型增生或疑有癌變者；長期服用非甾體類抗炎藥(NSAIDs)者；合并心、腦、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、精神病患者；年齡小于18歲或70歲以上，妊娠或哺乳期婦女；過敏體質(zhì)或?qū)Ρ狙芯恐兴盟幬镞^敏者；未按規(guī)定服藥或擅自服用其他藥物影響療效判定者；資料不全者。

1.5 治療方法

A組給予清化逆萎湯，藥物組成：太子參10 g，炒白術(shù)10 g，法半夏6 g，麥冬20 g，黃芩10 g，仙鶴草15 g，莪術(shù)15 g，白花蛇舌草15 g，半枝蓮15 g。反酸、燒心明顯者加用烏賊骨、浙貝母；胃脹較甚者加用佛手、枳殼；納差、食后脹甚者加用炙雞內(nèi)金、炒谷麥芽；口干咽燥、舌紅無苔等胃陰不足明顯者加用玉竹、石斛、百合；胃寒者去黃芩酌加干姜、制附子等；舌苔厚膩、口干苦、濕邪較重者去麥冬、白術(shù)加厚樸、蒼術(shù)、薏苡仁；大便干結(jié)加萊菔子、決明子；大便夾有黏液、不盡感加黃連、木香、馬齒莧；情志不暢、痛連兩脅者加柴胡、白芍、合歡花、玫瑰花等；夜寐不安者酌加百合、夜交藤、生龍齒等。中藥煎劑或等劑量顆粒劑(均來自東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院中藥房)，每日1劑，分2次(早晚飯后30 min)口服，每次150 ml。B組給予胃復(fù)春4片，每日3次，口服(杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，Z 2004003)，葉酸片5 mg，每日3次口服。C組根除HP后不再給予特殊治療，觀察A、B、C 3組周期均為6個(gè)月。

1.6 觀察項(xiàng)目及方法

1.6.1 臨床癥狀 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年版)，將臨床常見癥狀(胃脹、胃痛、噯氣、食少納呆、口干口苦、惡心嘔吐、吐酸嘈雜、乏力、大便情況等9項(xiàng))按無、輕、中、重分別量化記為0、1、2、3分，記錄治療前后積分，具體量化標(biāo)準(zhǔn)見參考文獻(xiàn)[8]。

1.6.2 胃鏡和病理觀察 采用內(nèi)鏡窄帶成像(NBI)技術(shù)確定病變范圍，對(duì)病灶明顯處以四象限法各取活檢1塊，每塊均行病理檢查，按照萎縮、異型增生的無、輕、中、重度分別量化標(biāo)記為 0、1、2、3分，兩者均以病變最嚴(yán)重處記分。

1.6.3 免疫組化 所用試劑包括PTEN(人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源的基因)抗體(abcam公司，貨號(hào)ab228466)；AKT(絲氨酸/蘇氨酸激酶)(abcam公司，貨號(hào)ab8805)；即用型快速免疫組化Max VisionTM試劑盒、DAB顯色劑(中杉公司，貨號(hào)ZLI-9018)。采用免疫組化二步法，以PBS液(Biosharp公司，貨號(hào)BL302A)代替一抗作為陰性對(duì)照以檢測(cè)抗體(PTEN抗體，濃度為1∶400；AKT抗體，濃度為1∶500)特性[9]。每例病理切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野觀察腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞核著色情況。陽性細(xì)胞PTEN以胞漿呈棕黃色為主，AKT以胞漿或胞核呈棕黃色為主，陰性不著色。根據(jù)染色的程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：按照基本不著色、淡黃色、棕色、深棕色分別記為0、1、2、3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率：<5%為0分；5%～25%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分?；虮磉_(dá)得分=染色程度分值×染色細(xì)胞百分率分值[10]。

1.7 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導(dǎo)原則》[8](2002版)進(jìn)行優(yōu)化，包括中醫(yī)證候療效及病理療效。中醫(yī)證候療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：痊愈：療效指數(shù)≥90%；顯效：90%>療效指數(shù)≥60%；有效：60%>療效指數(shù)≥30%；無效：療效指數(shù)<30%。療效指數(shù)=(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%。病理療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：痊愈：萎縮、異型增生均消失；顯效：萎縮、異型增生減輕2個(gè)級(jí)度及以上，但未達(dá)痊愈標(biāo)準(zhǔn)；有效：萎縮、異型增生減輕1個(gè)級(jí)度，但未達(dá)痊愈標(biāo)準(zhǔn)；無效：萎縮、異型增生無改善甚至加重。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證候療效比較

表1示，治療前后中醫(yī)證候療效總體有效率A組(90.91%)明顯高于B組(68.18%)、C組(40.91%)，3組間比較差異顯著(P<0.01)。

表1 3組治療前后中醫(yī)證候改善情況比較[例(%)]

2.2 病理組織學(xué)療效比較

表2～4示，治療前后萎縮、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變改善情況A組明顯優(yōu)于B組、C組，病理總體有效率A組(68.18%)明顯高于B組(45.45%)、C組(27.27%)，組間比較差異顯著(P<0.05)。

表2 3組治療前后萎縮變化情況比較

表3 3組治療前后低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(異型增生)變化情況比較

表4 3組治療前后病理改善情況比較[例(%)]

注：箭頭所示：a、b、c、e示萎縮、腸化;d示萎縮、腸化、中度不典型增生;f、g示慢性炎癥細(xì)胞浸潤圖1 典型病例(清化逆萎湯組)治療前后病理形態(tài)變化比較(胃竇HE×100)

2.3 免疫組化治療前后PTEN、AKT積分比較

表5示，治療前后A、B、C 3組PTEN積分均有不同程度升高，AKT積分均有不同程度降低，但A組治療后PTEN積分升高，AKT積分降低程度均較B組、C組更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且與本組治療前比較，A組治療后PTEN、AKT積分表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表5 3組患者治療前后胃黏膜病灶局部PTEN、AKT免疫組化積分結(jié)果比較

3 討論

我國是胃癌高發(fā)國家，其發(fā)病率僅次于肺癌居第二位，死亡率排第三位[11]。CAG癌變率約為0.5%～1%，若伴有中重度腸化和上皮內(nèi)瘤變等，其癌變率有明顯的上升趨勢(shì)[6]。研究表明，Hp感染能誘導(dǎo)血管新生，是促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移的重要因素[12]。倘若不針對(duì)Hp進(jìn)行積極干預(yù)治療，不論是否已經(jīng)發(fā)展為癌前病變(萎縮性胃炎、腸上皮化生甚至上皮內(nèi)瘤變)，后果都是不堪設(shè)想的。因此，本研究在納入臨床病例時(shí)，首先對(duì)Hp是否陰性進(jìn)行了篩選，以排除Hp對(duì)病情發(fā)展影響的干擾，為最終研究的可靠性提供了良好的保障。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，CAG伴LGIN屬于“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇[13]，其病位在胃(脾)，病理性質(zhì)屬虛實(shí)夾雜，外邪犯胃、情志失調(diào)、飲食不節(jié)等皆為本病的常見病因。然細(xì)究其發(fā)病根源，總不離脾胃虛弱，即“脾常不足”?！鞍俨〗杂善⑽杆ザ盵14]，脾胃虛弱貫穿了CAG伴LGIN的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》云：“脾以升為健，胃以降為和”[15]，二者升降相依，為一身氣機(jī)升降之樞，若脾胃虛弱，升降失常，脾氣不升反陷，胃氣不降反逆，則易致中焦失衡，氣機(jī)滯塞。又云：“太陰濕土，得陽始運(yùn)；陽明燥土，得陰自安。以脾喜剛燥，胃喜柔潤也。[15]”若脾胃虛弱，運(yùn)化水濕不利，水反為濕，谷反為滯，不論內(nèi)生濕邪抑或濕邪外感，均易致濕邪為患，燥濕失宜，且濕蘊(yùn)日久又有化熱傷陰之虞?！俺醪≡跉?久必入血”。氣滯、濕阻日久則久病必瘀，瘀血不祛則新血不生，臟腑失養(yǎng)，脾胃益虛。如此惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致胃黏膜逐步向萎縮、腸化、上皮內(nèi)瘤變甚至胃癌轉(zhuǎn)化。綜上，CAG伴LGIN的主要病機(jī)大致可歸納為脾胃虛弱(氣虛為主或有陰傷)為其本，濕熱、血瘀為其標(biāo)[16]，治當(dāng)益氣養(yǎng)陰為其要，佐以清熱化濕、活血祛瘀，遂擬清化逆萎湯(太子參10 g，炒白術(shù)10 g，法半夏6 g，麥冬20 g，黃芩10 g，仙鶴草15 g，莪術(shù)15 g，白花蛇舌草15 g，半枝蓮15 g)。

方中太子參配炒白術(shù)益氣健脾，顧護(hù)后天之本，脾胃健運(yùn)，中焦得充，則氣機(jī)升降恢復(fù)，此乃治病之本；半夏配麥冬取“麥門冬湯”之意，麥冬配半夏養(yǎng)胃生津而無滋膩之弊，半夏得麥冬降逆止嘔而無溫燥之嫌[17]；黃芩配仙鶴草清熱瀉胃之力有增，但不似芩連有苦寒?dāng)∥钢祝蚁生Q草尚于清瀉之中寓固本之意[18]；莪術(shù)與太子參、炒白術(shù)相合消補(bǔ)兼施，補(bǔ)而不滯，消而不傷正。全方合用益氣健脾治其本、清熱化濕、活血化瘀治其標(biāo)，標(biāo)本兼顧，消補(bǔ)兼施甚合法理。而從現(xiàn)代中藥藥理學(xué)角度分析，方中大多數(shù)藥物均有一定的抗腫瘤作用。如太子參具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫、抗菌、抗氧化等作用，可降低癌癥死亡率，對(duì)消化道腫瘤有抑制作用[19]；白術(shù)能減少瘤細(xì)胞的增殖，降低腫瘤細(xì)胞侵襲[20]；半夏提取物及其化學(xué)成分具有良好的抗腫瘤作用，包括肝癌[21]、胃癌[22]等；仙鶴草除了有良好的保護(hù)細(xì)胞免疫功能及免疫調(diào)節(jié)作用外，尚能抑殺幽門桿菌，抑制人胃癌細(xì)胞株(BGC-803)的生長[23]；此外，麥冬[24]、黃芩[25]、蛇舌草[26]、半枝蓮[27]、莪術(shù)[28]等均在一定程度上體現(xiàn)了較好的抑菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用。

從免疫組化、基因角度對(duì)清化逆萎湯方進(jìn)行分析顯示，癌基因、抑癌基因、凋亡調(diào)控基因等調(diào)節(jié)，在誘發(fā)胃黏膜萎縮及癌變過程起到重要作用[29]。本研究選擇的PTEN是一種具有雙重特異性蛋白磷酸酶活性、脂質(zhì)磷酸酶活性[30]的抑癌基因，AKT則是一種癌基因，有Akt1、Akt2、Akt3 亞型。目前已有研究證明，PTEN、AKT的調(diào)控作用在胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[31]。PTEN可以通過一定途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與胃黏膜萎縮病變過程[32]，從慢性萎縮性胃炎、異型增生到胃癌的過程中，其基因表達(dá)隨病理級(jí)別增加呈遞減趨勢(shì)[33]。而AKT的活化與腫瘤(包括胃癌、卵巢癌等[34])的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，也有多項(xiàng)研究顯示，PTEN與AKT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即PTEN的表達(dá)越弱Akt2蛋白的表達(dá)就越強(qiáng)，提示萎縮性胃炎發(fā)展至胃癌的過程與PTEN的低表達(dá)或基因缺失及AKT的高表達(dá)水平密切相關(guān)[35]。本研究通過對(duì)比治療前后PTEN、AKT表達(dá)得分變化情況可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)清化逆萎湯治療后PTEN明顯上調(diào)，與之相反，AKT呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。

綜上所述，清化逆萎湯治療CAG伴LGIN臨床療效確切，不但能顯著改善胃痛、痞滿等不適癥狀，而且能消除胃黏膜顆粒狀增生，改善胃黏膜供血，逆轉(zhuǎn)部分腺體萎縮和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。此外，清化逆萎湯可上調(diào)抑癌基因 PTEN，下調(diào)癌基因AKT表達(dá)，揭示其作用機(jī)理可能為通過誘導(dǎo)胃癌前病變細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞過度生長，從而逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮及低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。