乳腺癌耐藥動物模型建立及咯萘啶(PND)逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的效果觀察

王新征 侯永強(qiáng) 汲權(quán)威

化療是控制腫瘤的有效方法，但多藥耐藥(MDR)是化療失敗的重要原因。目前，尋找積極的措施逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥迫在眉睫?？汞懶滤幙┹拎?PND)是1種逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的新藥，其是否具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用尚在研究。本研究選擇人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和其耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM建立裸鼠荷人腫瘤耐藥和敏感細(xì)胞移植瘤模型，以評估抗瘧新藥咯萘啶(pyronaridine，PND)的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的體內(nèi)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品：胎牛血清，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所生產(chǎn)；注射用鹽酸阿霉素；注射用順鉑；注射用磷酸咯萘啶，由天津藥物研究院；實(shí)驗(yàn)所用藥均以無菌蒸餾水配成相應(yīng)濃度備用。

1.1.2 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7和耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM；常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 alb/c裸鼠(nu/nu)，雌性，5.7周齡，體重16～229，購自中國生物制品鑒定所動物中心。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外分光光度計UV-3000型、高壓液相色譜儀Waters510；酶標(biāo)儀Microplate Reader450；流式細(xì)胞儀；激光光密度掃描儀；高速臺式離心機(jī)TGL-16c；低溫離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)操作

1.2.1 裸鼠移植瘤單側(cè)模型的建立 采用人耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM和乳腺細(xì)胞系MCF-7接種于裸鼠上，建立耐藥單側(cè)和腫瘤敏感模型。接種位置在右側(cè)前肢根部背側(cè)，單只小鼠接種細(xì)胞數(shù)量為0.2 ml，腫瘤以每6～9天100～300 mm3的速度生長，隨機(jī)分組，各組為6只小鼠。

1.2.2 體內(nèi)抗耐藥腫瘤活性試驗(yàn) 分組為3組：對照組A組、對照組B組、觀察組。A組注射相應(yīng)溶劑；B組注射阿霉素；觀察組注射不同劑量的PND，高劑量∶中劑量∶低劑量=4∶2∶1。耐藥移植腫瘤接種后第9天開始給藥，移植腫瘤接種后第6天開始給藥，每隔3天給藥1次，腹腔注射。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn)

裸小鼠移植瘤模型使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，觀察抗腫瘤療效，每3天測量一次腫瘤直徑。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤動物模型建立結(jié)果

2.1.1 MCF-7/ADM裸鼠移植瘤的生長特性 觀察MCF-7/ADM敏感細(xì)胞接種后第6天的生長狀況，對體積>100 mm3的成瘤進(jìn)行收集；在MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞接種后第9天進(jìn)行收集。隨著時間的延長，腫瘤體積增大，并且耐藥腫瘤和敏感腫瘤的生長速度相當(dāng)，無明顯差異。

2.1.2 裸鼠移植瘤對ADM的耐藥特性 在無菌條件下，取裸鼠腫瘤組織制作單細(xì)胞懸液，評估MCF-7/ADM裸鼠移植瘤對阿霉素的耐藥作用，裸鼠移植瘤MCF-7/ADM細(xì)胞ICSO達(dá)到180.5 pg/ml，耐藥倍數(shù)達(dá)到56倍，和體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞對比，裸鼠移植瘤MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥倍數(shù)下降，但是耐藥特性良好。

2.2 PND聯(lián)合ADM裸鼠移植瘤生長的抑制和對裸鼠體重的影響

與對照組B組對比，低劑量和中劑量聯(lián)合組抑瘤率無明顯差異，P>0.05；高劑量聯(lián)合組抑瘤率明顯更高，數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。見表1。對照組A組和低劑量(1 mg/kg)聯(lián)合組的體重?zé)o顯著差異，P>0.05；和對照組A組對比，中劑量(2 mg/kg)聯(lián)合組、高劑量(4 mg/kg)聯(lián)合組和對照組B組明顯降低，數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；和對照組B組對比，高劑量(4 mg/kg)聯(lián)合組治療后小鼠體重明顯降低，數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。見表2。

表1 PND聯(lián)合ADM對裸鼠移植瘤生長的抑制的影響

表2 PND聯(lián)合ADM對裸鼠體重的影響

3 討論

3.1 腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制在于以下幾點(diǎn)[1-8]：其一，耐藥藥理，主要是由于機(jī)體對于藥物的反應(yīng)所導(dǎo)致的，當(dāng)藥物進(jìn)入人體時，由于代謝提高導(dǎo)致藥物在體內(nèi)的穿透力較差，所以導(dǎo)致細(xì)胞外的藥物濃度較低。其二，細(xì)胞耐藥，由腫瘤細(xì)胞的遺傳特點(diǎn)、生化特點(diǎn)所致，導(dǎo)致細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥，可通過細(xì)胞膜-核膜蛋白-藥物輸出的途徑，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物排出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低；也可通過細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)蛋白的途徑，促使藥物靶酶質(zhì)和量都改變，例如降低DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶含量及活性，增強(qiáng)06-甲基鳥嘌嶺-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，增強(qiáng)DNA修復(fù)功能。其三，凋亡耐藥，抗腫瘤藥物需通過細(xì)胞凋亡促使腫瘤細(xì)胞死亡，促凋亡基因喪失對腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生起著一定的作用。由此可見，腫瘤耐藥影響因素來自于多方面，隨著誘導(dǎo)藥物、癌細(xì)胞的微環(huán)境及類型變化而表現(xiàn)出不同的耐藥表型。相關(guān)研究證明[9-10]，因?yàn)轶w內(nèi)毒性濃度不及體外的有效逆轉(zhuǎn)濃度，多數(shù)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物雖然可在血液腫瘤中發(fā)揮著一定的效果，但是應(yīng)用于實(shí)體瘤中效果欠佳。目前，世界上尚無一種耐藥逆轉(zhuǎn)劑納入臨床公認(rèn)的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥劑，必須開發(fā)新的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑。

3.2 PND聯(lián)合ADM對裸鼠移植瘤生長的抑制

在評估腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑的作用中，體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果是重要的指標(biāo)之一。本研究選取人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和其耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM建立模型，并且以此評估PND在體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR作用。根據(jù)ADM和PND各自的藥物代謝動力學(xué)特點(diǎn)和最大耐受量，研究顯示不同劑量ADM+PND聯(lián)合治療組對MCF-7/ADM移植瘤的腫瘤生長具有明顯差異。與對照組B組對比，低劑量和中劑量聯(lián)合組抑瘤率無明顯差異，P>0.05；高劑量聯(lián)合組抑瘤率明顯更高，數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。提示PND具有明顯的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用。

3.3 PND聯(lián)合ADM對裸鼠體重的影響

在觀察抗腫瘤藥物的療效同時，也必須觀察PND抗腫瘤治療的毒性，通過觀察治療后裸鼠的體重變化可間接體現(xiàn)出藥物的毒性作用[11]，結(jié)果表明，和對照組A組對比，中劑量(2 mg/kg)聯(lián)合組、高劑量(4 mg/kg)聯(lián)合組和對照組B組明顯降低，數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；和對照組B組對比，高劑量(4 mg/kg)聯(lián)合組治療后小鼠體重明顯降低，數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。

但大多數(shù)能夠耐受，停藥后小鼠體重不再繼續(xù)下降，結(jié)果提示裸鼠的體重下降與藥物相關(guān)，聯(lián)合高劑量的ADM和PND能夠提高療效，但同時也增加了毒性。

綜上所述，PND具有高效的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用，可作為一種新的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑。