TLRs信號通路在干眼發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

李寶花，寧博彪，魏宇嬌，唐雪鳳，葛惠玲，馬芬俞

0引言

國際干眼共識(TFOS DEWS Ⅱ)的定義和分類小組重新定義了干眼的概念：干眼(dry eye disease，DED)是眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經(jīng)感覺異常[1]。DED主要臨床表現(xiàn)為眼睛異物感、干澀感、燒灼感、畏光、視物模糊和視疲勞。DED所造成的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和對個人視力、生活質(zhì)量和生產(chǎn)力產(chǎn)生的不利影響以及疼痛對身體和心理的影響都是值得思考的。明確干眼的發(fā)病機(jī)制，對于干眼的防治顯得尤為重要。越來越多的研究表明，炎癥在干眼發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，因此干眼的炎癥機(jī)制及抗炎治療已成為近年研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究顯示Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)及其信號系統(tǒng)表達(dá)的調(diào)控在干眼的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用[2-3]。本文總結(jié)近10a來有關(guān)TLRs對干眼免疫應(yīng)答的研究，探討通過對TLRs信號通路的調(diào)節(jié)及控制以達(dá)到對干眼的治療及預(yù)防。

1 Toll樣受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Toll樣受體是先天免疫系統(tǒng)的模式識別受體，可識別高度保守的微生物結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物[4]。目前，15種TLRs已被人類發(fā)現(xiàn)，TLR1～TLR9為人鼠所共有，TLR10只存在于人類，TLR11、TLR12及TLR13只存在于鼠類，TLR14以及TLR15已經(jīng)在鼠與雞內(nèi)有所發(fā)現(xiàn)，也有人認(rèn)為TLR14為人、鼠共有[5]。

1.1 TLRs的組織結(jié)構(gòu)TLRs家族是一個高度重合的同源家族，其基本的結(jié)構(gòu)組成包括3個部分，分別為：胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。十余個含有亮氨酸的堿基重復(fù)序列相連接而構(gòu)成胞外段，MD-1、MD-2和RP105是其重要的輔助蛋白，胞外段的主要作用就是識別與其相應(yīng)的配體，來傳遞其所需要傳遞的信息。胞內(nèi)段的主要亮點(diǎn)在于髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，MyD88是一種用來轉(zhuǎn)換以及傳達(dá)信號的蛋白，參與著TLRs的信號傳遞，以完成整個信號通路的信息傳導(dǎo)[6]。

1.2 TLRs的微生物配體正如上面所提到的，胞外段的主要作用就是識別與其相應(yīng)的配體，故而因其TLRs的不同，與其相應(yīng)的配體也分別各有差異。TLR1，2，4，5，6和10的識別受體通常顯示在細(xì)胞表面上，與其相應(yīng)的配體相結(jié)合；而TLR3，7，8和9通常位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體膜上，因?yàn)樗鼈兊奶烊慌潴w可能僅存在于細(xì)胞的酸性區(qū)室中[7]。特定的TLRs結(jié)合相應(yīng)的特意性配體，如：TLR3識別病毒的雙鏈dsRNA；TLR5識別細(xì)菌鞭毛蛋白；TLR6主要與TLR2協(xié)同作用識別細(xì)菌的PGN和脂肽；TLR7和TLR8對病毒性單鏈RNA起反應(yīng)；TLR9可介導(dǎo)對細(xì)菌CpGDNA的胞內(nèi)反應(yīng)。

1.3 TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路每一個TLRs家族成員必須依賴于Toll樣受體特定的組成結(jié)構(gòu)向相應(yīng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)的信息，與其特有的轉(zhuǎn)接蛋白相接觸，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、絲裂原蛋白激酶(MAPK)p38、IFN誘導(dǎo)因子等被激活、傳遞信息，操縱的特定基因激活并表達(dá)。MyD88、MyD88-轉(zhuǎn)接體樣/TIR-相關(guān)蛋白(MAL/TIRAP)、Toll受體相關(guān)分子(TRAM)、誘導(dǎo)IFN-β的含TIR結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)接體(TRIF)和SARM，這5種轉(zhuǎn)接蛋白，參與著TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)。其中，MyD88和TIR結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)接體能夠激活下游酶，其特有的酶鏈反應(yīng)激活信號通路的表達(dá)，而Toll受體相關(guān)分子和MyD88-轉(zhuǎn)接體樣/TIR-相關(guān)蛋白，其作用機(jī)制是轉(zhuǎn)運(yùn)髓樣分化因子88以及TIR結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)接體，同樣誘導(dǎo)TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，接頭蛋白SARM則與TLRs信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)。

上面所說的特異性接頭蛋白，將TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑，也是其最根本的轉(zhuǎn)導(dǎo)方式[8]。MyD88依賴性途徑是大多數(shù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中某些Toll樣受體胞外段識別與其相應(yīng)的配體結(jié)合以后，直接作用于髓樣分化因子88，比如TLR5、TLR7、TLR8和TLR9；而TLR4、2不能直接作用于髓樣分化因子88，中間要先形成二聚體、結(jié)合橋梁接頭蛋白Mal，才可以發(fā)揮轉(zhuǎn)接作用。整個途徑所活化及磷酸化的因子及化合物有TAK1、IKK復(fù)合物及IkB，IkB降解以后，NF-κB才能轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α活化，完成炎癥反應(yīng)的整個過程。髓樣分化因子88的非依賴途徑很少被利用，只有TLR3、專門修飾后的TLR4以及TLR5所利用，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-β活化，同樣誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的最終表達(dá)[9]。

以TLR4為例，TLR4不但能激活髓樣分化因子88依賴途徑，而且還能激活髓樣分化因子88的非依賴途徑。MyD88依賴途徑：TLR4與特異性配體相結(jié)合以后，與橋梁接頭蛋白Mal相結(jié)合以后，與髓樣分化因子88的一端相結(jié)合，而另一端與白介素受體酶1和2相結(jié)合，并使其磷酸化，然后激活TNF6，活化TAK1，IkB磷酸化并降解，活化髓樣分化因子88，轉(zhuǎn)位在細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)白介素1、6、8等炎癥因子的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而使炎癥發(fā)生[10-11]。MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：髓樣分化因子88不被激活，主要是通過激活β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing inter feron-β，TRIF)完成的，其過程也是活化NF-κB活化因子以及其它炎癥因子，而激發(fā)炎癥反應(yīng)[12-13]。

2 TLRs及其信號通路在干眼中的表達(dá)

干眼是以淚膜穩(wěn)定性失常為主要特點(diǎn)，伴有眼部干澀感、異物感、眼紅、酸澀感等癥狀的眼表炎癥疾病，近些年的研究將干眼的作用機(jī)制主要關(guān)注于：淚膜穩(wěn)態(tài)失常、淚液高滲透性以及局部炎癥反應(yīng)[14]。隨著環(huán)境污染加劇、電子產(chǎn)品的大規(guī)模運(yùn)用以及社會壓力的不斷增加而導(dǎo)致不良的生活作息及飲食失宜的不斷加劇，使干眼發(fā)病的腳步進(jìn)一步加快。發(fā)病率不斷升高的干眼危及著越來越多的人類生活，輕者影響生活質(zhì)量，重者導(dǎo)致患者角膜上皮的缺損、角膜發(fā)生新生血管、角膜翼障、角膜的損傷、視力下降甚至失明。

干眼的發(fā)病因素復(fù)雜，炎癥作為干眼不可推卸的責(zé)任，有待我們進(jìn)一步思考，眼表的高滲透性與炎癥反應(yīng)不斷地刺激眼表的穩(wěn)態(tài)，炎癥的不斷刺激，眼表的神經(jīng)末梢受損，對外界的刺激越來越不敏感，進(jìn)而瞬目減少，加重干眼患者的眼表不適感進(jìn)一步加重，成為惡性循環(huán)，尋求其最根本的作用機(jī)制已經(jīng)成為大勢所趨，相應(yīng)的抗炎治療引起越來越多的熱議[15-17]。目前眾多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明與眼表炎癥相關(guān)的因子有很多[18-24]，比如白細(xì)胞介素：IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-1β，腫瘤壞死因子：TNF-α、TNF-β，Toll樣受體：TLR2、4、9，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等。

干眼患者眼表的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，眾多研究已經(jīng)表明，TLRs及其信號系統(tǒng)的表達(dá)在干眼的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用，其信號通路的高度表達(dá)，誘發(fā)并加重其炎癥的表達(dá)[25]。所以，與之相關(guān)的研究應(yīng)當(dāng)重視其通路的作用機(jī)制，探究其與干眼的高度相關(guān)性，為干眼的診斷及治療尋找更有效且長久的理論依據(jù)。

2.1 TLRs在干眼相關(guān)組織中的表達(dá)干眼所參與的功能單位主要涉及到淚膜、角膜、結(jié)膜、淚器(主要是淚腺)、瞼板腺等。這些組織對于保證淚液的正常分泌，以及維持眼表的正常潤澤，保證正常的視物功能，有著重要的作用。其中任一組分的損害均可導(dǎo)致淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失，而淚膜的持續(xù)異常可進(jìn)一步引起上述功能單位中其他組分的病理改變，進(jìn)而導(dǎo)致干眼的發(fā)生[26-29]。綜上所述，各種原因?qū)е碌慕悄ど掀さ娜睋p，角膜的新生血管、角膜翼障、角膜的損傷以及角膜瘢痕等不僅可以導(dǎo)致干眼，也可以互為因果、相互加重。

2.1.1 TLRs在角膜中的表達(dá)Rachel等已經(jīng)證明Toll樣受體在干眼中高度表達(dá)，給予高滲透環(huán)境，檢測角膜上皮細(xì)胞中的TLR4、TLR9均有所表達(dá)，而TLR5 mRNA則無表達(dá)，TLR4增加8.18倍，TLR9減少0.58倍；給予干燥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)TLR4和TLR5 mRNA均上調(diào)、TLR9 mRNA則下調(diào)，其相應(yīng)的表達(dá)分別為4.81、2.51、0.86倍[30]。Lee等[4]研究結(jié)果表明干眼的炎癥由TLR4信號通路所誘導(dǎo)，其水平與干眼的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)。Chinnery等[31]研究了上皮清創(chuàng)術(shù)后小鼠TLR9配體誘導(dǎo)的角膜炎癥的機(jī)制，結(jié)果數(shù)據(jù)顯示局部應(yīng)用CpG寡脫氧核苷酸(ODNs)，可以使TLR9活化而誘導(dǎo)眼內(nèi)炎癥，ODNs除可以誘導(dǎo)干眼以外，還可誘導(dǎo)其它炎癥。Li等[3]研究顯示，TLR4存在于正常人的角膜內(nèi)，當(dāng)炎癥增加時，其水平隨著干眼的程度升高。周芳等[32]研究大鼠角膜堿燒傷早期炎癥反應(yīng)的動物實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示TLR2、TLR4不僅參與了角膜堿燒傷的炎癥反應(yīng)，而且還誘導(dǎo)并促進(jìn)其加重。以上數(shù)據(jù)均表明角膜中表達(dá)Toll樣受體，而且在炎癥來臨時Toll樣受體發(fā)揮出至關(guān)重要的作用。

2.1.2 TLRs在結(jié)膜和淚腺中的表達(dá)Micera等[33]已經(jīng)證實(shí)了TLR4、TLR9參與了春季角膜結(jié)膜炎的發(fā)生，導(dǎo)致結(jié)膜上皮中TLR4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和TLR9轉(zhuǎn)錄下調(diào)。Reins等[34]證實(shí)干眼眼表結(jié)膜中TLR2、4、9表達(dá)，以及淚腺中TLR5表達(dá)均有不同程度的增加。Barabino等[2]研究顯示干眼患者的眼表損害伴著TLR9表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)一步證明TLR信號通路參與著干眼的眼表炎癥。Rachel等研究干眼炎癥中TLRs和抗微生物肽(AMP)的表達(dá)[35]。結(jié)果實(shí)驗(yàn)性干眼上調(diào)瞼結(jié)膜中的TLR2、3、4和9 mRNA表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在角膜上皮中也發(fā)生了TLR2、3和9 mRNA的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)淚腺中TLR2、TLR5有所上調(diào)，總體而言，TLRs蛋白有相應(yīng)的變化。楊青霞等[36]探討五羥色胺在攝取抑制劑引起干眼的潛在機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中，證明氟西汀可激活結(jié)膜上皮細(xì)胞中TLR2/NF-κB信號通路，進(jìn)而抑制了干眼的眼表炎癥。

2.2 TLRs在干燥綜合征中的表達(dá)干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)是一種慢性炎癥性自身免疫病。干燥綜合征其中最重要的臨床表現(xiàn)就是眼干、口干。Marie等以20例原發(fā)性干燥綜合征患者和20例健康對照者做實(shí)驗(yàn)，并檢測外周血中TLR1-10蛋白及mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SS患者TLR8 mRNA水平顯著高于對照組，而TLR9 mRNA水平顯著低于對照組，TLR5顯著減少，TLR7顯著增加[37]。Ainola等[38]用凋亡細(xì)胞培養(yǎng)基連續(xù)離心步驟收集的凋亡顆粒，對SS自身抗原在這些顆粒中的表達(dá)和定位進(jìn)行了分析，結(jié)果表明雄激素保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡，影響自身抗原的重新分布，并減少細(xì)胞凋亡刺激顆粒的增加。Nakamura等[39]研究了Toll樣受體等先天性免疫細(xì)胞，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及TLR9參與誘導(dǎo)了SS患者的炎癥，TLR3還可以誘導(dǎo)SS患者唾液腺上皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致干燥綜合征的產(chǎn)生。由此我們可以猜想這些信號通路對淚腺是不是也有相似的作用。

這些數(shù)據(jù)初步表明，干眼的發(fā)病機(jī)制之中，TLRs差異性參與表達(dá)，并提示TLRs參與干燥綜合征的炎癥反應(yīng)，不論是SS型干眼還是非SS型干眼，其炎癥機(jī)制均與TLRs信號通路有密切的關(guān)系。目前尚不完全清楚其具體的機(jī)制及其結(jié)果。然而，無論病因如何，表達(dá)模式何如，更詳細(xì)的作用機(jī)制必將是研究的重點(diǎn)。

3不同干預(yù)方法對干眼TLRs通路的影響

3.1中藥對干眼TLRs通路的影響中醫(yī)以整體觀念為指導(dǎo)，注重辨證論治，強(qiáng)調(diào)調(diào)整恢復(fù)人體的整體陰陽平衡，眾多研究證明，中藥可以通過清熱解毒、滋陰、活血化淤等作用調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[40-42]。林崇澤等[43]觀察益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥對干燥綜合征的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰祛瘀中藥下調(diào)了血清TLR9表達(dá)，并且有效地緩解了眼睛干燥癥狀。黃綏心[44]觀察益氣養(yǎng)陰祛瘀方干預(yù)肥胖糖尿病自發(fā)性干燥綜合征的作用，結(jié)果表明TLR-IFN-BAFF信號通路參與了肥胖糖尿病自發(fā)性干燥綜合征的發(fā)生，并且益氣養(yǎng)陰祛瘀方下調(diào)TLR5、IFN-α、BAFF mRNA及蛋白的表達(dá)，并且有效地解決了小鼠的口干等癥狀。韋尼[45]通過觀察活血解毒方的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活血解毒方有效地增加了小鼠(NOD)的唾液分泌量，同時降低NOD小鼠血清TLR2、TLR4、CD14蛋白表達(dá)及頜下腺TLR2、TLR4、CD14 mRNA水平。孫會蘭[46]在研究逍生散顆粒劑對干眼小鼠模型角結(jié)膜組織TLR4及NF-κB影響的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明逍生散顆粒劑對小鼠干眼模型角結(jié)膜組織TLR4、NF-κB兩條通路均有抑制作用，進(jìn)而加快干眼的癥狀緩解。

3.2針灸對干眼TLRs通路的影響上面談到中醫(yī)的治療優(yōu)勢，而針灸可以改善病變局部的血液循環(huán),疏通經(jīng)絡(luò)，且副作用少、依賴性小、安全性高,是一種廣泛為大眾接受的綠色療法。毫針透刺法中的多種補(bǔ)瀉手法同樣可以實(shí)現(xiàn)所謂“消炎”之功[47]。張丹[48]觀察電針治療干眼的臨床療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針對TLRs/NF-κB信號通路有影響，并且很大程度緩解了干眼患者的癥狀，提高了生活質(zhì)量。

3.3其它一些中成藥、西藥、靶向藥等藥物的抗炎機(jī)制也是不可忽略的。Putranto等開發(fā)了RAGE肽抑制劑，在聚乙烯亞胺陽離子的作用下，傳遞于細(xì)胞內(nèi)，該肽與TLR-IL-1受體域結(jié)構(gòu)銜接蛋白相結(jié)合，進(jìn)一步阻斷了眼表炎癥的發(fā)生[49]。付榮嶸[50]的研究表明瑞巴派特對小鼠的結(jié)膜及淚腺中炎癥具有抑制作用，其作用機(jī)制為抑制TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá),從而阻止其炎癥反應(yīng)。

4結(jié)論與展望

近年來有關(guān)干眼的治療方法層出不窮，不可否認(rèn)的已經(jīng)收到很多突破性的研究，但就其發(fā)病率高及其現(xiàn)有的治療方法并未將其完全治愈引來越來越多的臨床工作者熱議，近年來干眼的炎癥機(jī)制及抗炎治療已成為研究的熱點(diǎn)，眾多的研究已經(jīng)證明，TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是干眼炎癥發(fā)生的重要機(jī)制，及其信號通路的調(diào)控在干眼的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。干眼的發(fā)生主要依賴于Toll樣受體上特異性接頭蛋白，將TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。

目前認(rèn)為炎癥是干眼發(fā)病的核心。TLRs在介導(dǎo)干眼的免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)多種炎性因子生成、啟動獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。TLRs在干眼相關(guān)組織角膜、結(jié)膜、淚腺、瞼板腺中均有表達(dá)，TLRs在干燥綜合征外分泌腺、唾液腺有相應(yīng)的表達(dá)，故TLRs參與非SS和SS干眼的病理生理學(xué)。通過調(diào)控TLR信號通路治療干眼可能是中藥、針灸、瑞巴派特及RAGE肽抑制劑等治療方法的作用機(jī)制之一。

然而，目前的研究對于TLRs及其信號系統(tǒng)的了解還不夠深入，除去目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的15種TLRs外，是否還有更多的TLRs未被人類所知道；除去所發(fā)現(xiàn)的MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑以外，是否還有其它的TLRs信號通路的表達(dá)途徑也是現(xiàn)有的技術(shù)未知的；TLRs家族成員之間有沒有必然的聯(lián)系，聯(lián)系的機(jī)制是怎樣的并未充分證明；藥物通過該信號通路作用于干眼的整個途徑中，從上游到下游所參與的所有因子的表達(dá)也不夠詳盡。此外，中醫(yī)藥運(yùn)用于干眼的臨床使用的方式也十分局限，目前的相關(guān)研究中多以中藥湯劑為主，雖然取得了一定程度上的療效，但缺乏其他有效手段如針灸、拔罐、按摩等的相關(guān)研究，導(dǎo)致中醫(yī)藥對于干眼的預(yù)防、治療等方面整體辨證、治病求本的優(yōu)勢還遠(yuǎn)未發(fā)揮出來。這些問題亟需大量的研究來證明、解決。