基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討射干麻黃湯治療哮喘的藥效物質(zhì)及作用機制

郭文軍，韓雨晴，黃鳳輝，徐曉航，解生旭，劉悅，徐雅娟※

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學院，吉林長春130012；3.葵花藥業(yè)集團（吉林）臨江有限公司，吉林白山134600）

哮喘是一種慢性疾病，主要特征是由氣道高反應性和炎癥引起的間歇性喘息、咳嗽和呼吸困難[1]。盡管醫(yī)學科學發(fā)展迅速，但哮喘仍然困擾著許多兒童和成人[2]。糖皮質(zhì)激素類、抗膽堿能藥物是西醫(yī)治療哮喘的首選藥，但只能減輕哮喘發(fā)作癥狀、減少發(fā)作次數(shù)，并且大量使用上述藥物容易導致多種不良反應[3,4]。射干麻黃湯出自《金匱要略》卷上，具有溫肺化飲，下氣祛痰之功效[5]?，F(xiàn)代藥理學研究表明射干麻黃湯可以通過祛痰、抗炎和氣道重塑治療哮喘[6,7]，但中藥具有多組分協(xié)同發(fā)揮作用的特點，基于單一靶點研究作用機制具有很大局限性。網(wǎng)絡藥理學“整體觀”與“辨證論治”的研究思維符合中藥多組分、多靶點及多途徑的治療機制，其研究方法通過蛋白質(zhì)與化合物相互作用基礎上建立，是開發(fā)中藥活性成分、探索中藥作用機制的強有力手段[8,9]。本課題組前期完成了射干麻黃湯制劑研究，建立了大鼠哮喘模型進行藥效研究，結(jié)果證明射干麻黃湯可減輕支氣管炎癥浸潤程度、氣道炎癥反應及對肺臟病理損傷而達到治療哮喘作用，但基于大鼠等動物模型的射干麻黃湯的網(wǎng)絡藥理學分析未見報道[10,11]，本文選擇物種為“大鼠”通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術分析探討射干麻黃湯治療哮喘的藥效物質(zhì)基礎和作用機制，并進行分子模擬輔助驗證，為后續(xù)開展射干麻黃湯藥效物質(zhì)基礎和作用機制的動物實驗研究提供參考。

1 實驗方法

1.1 射干麻黃湯有效成分篩選

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP：https://tcmspw.com/tcmsp.php/）是一個獨特的中藥系統(tǒng)藥理平臺，可捕獲藥物、靶點和疾病之間的關系[12]，利用TCMSP檢索射干麻黃湯中半夏、大棗、款冬花、麻黃、射干、生姜、五味子、細辛和紫菀含有的化合物，并設置化合物的口服利用度（OB≥40%）、類藥性（DL≥0.2）和半衰期（HL≥4）篩選射干麻黃湯有效成分。

1.2 有效成分作用靶點預測

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisst argetprediction.ch/）是一個根據(jù)有效成分與數(shù)據(jù)庫中已知活性物質(zhì)2D和3D結(jié)構(gòu)的相似度來預測有效成分作用靶點的web服務器。利用TCMSP和pubchem數(shù)據(jù)庫獲取射干麻黃湯有效成分的mol2格式的結(jié)構(gòu)文件或Canonical SMILES結(jié)構(gòu)式，導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“大鼠”來獲取有效成分作用靶點，Probability*值大于0的靶點即為有效成分的作用靶點。

1.3 有效成分―靶點―哮喘（C-T-D）網(wǎng)絡構(gòu)建及關鍵活性成分獲取

以“asthma”為關鍵詞在Gene cards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中獲取哮喘的治療靶點，其中Relevance score≥2倍中位數(shù)的靶點被視為治療哮喘的靶點。利用Venn分析將哮喘的治療靶點和有效成分作用靶點取交集得射干麻黃湯對哮喘的治療靶點，將具有活性成分、哮喘以及治療靶點信息的數(shù)據(jù)集導入Cytoscape軟件進行C-T-D網(wǎng)絡圖構(gòu)建和可視化，根據(jù)節(jié)點度的大小對網(wǎng)絡進行拓撲分析，并根據(jù)“節(jié)點度＞中位數(shù)”篩選出射干麻黃湯關鍵活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建及關鍵靶點的獲取

PPI網(wǎng)絡作為一種新的藥物研究方法，可用于闡明預測目標與其他蛋白之間的關系。String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）是用于搜索蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，它提供有關蛋白質(zhì)預測和相互作用的信息。利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建射干麻黃湯治療哮喘靶點的PPI網(wǎng)絡，并通過Cytoscape軟件進行可視化，隨后將關鍵活性成分映射在PPI網(wǎng)絡圖中構(gòu)建關鍵活性成分―PPI網(wǎng)絡圖，圖中靶點連接度越大，與它連接的蛋白或活性成分就越多，它在哮喘發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮的作用就越重要，據(jù)此篩選關鍵活性成分作用的關鍵靶點。

1.5 功能富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）是對基因提供一套全面功能注釋，以了解大量基因背后的生物學含義的工具。將PPI網(wǎng)絡圖中的靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“大鼠”，以P＜0.05為條件進行KEGG Pathway、生物學過程（biological process,BP）、細胞組成（cell composition,CC）、分子功能（molecular function,MF）富集。

1.6 分子對接

從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）下載目標靶點結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件去除靶點結(jié)構(gòu)的結(jié)晶水和其他小分子，并將其保存為pdb格式，然后將結(jié)構(gòu)文件放入AutoDockTool 1.5.6程序中，添加原子電荷，并在添加氫原子后將其保存為pdbqt格式。將射干麻黃湯關鍵活性成分的mol2格式的結(jié)構(gòu)文件放入AutoDockTool程序，添加原子電荷并將其保存為pdbqt格式作為對接配體。使用Autodockvina軟件模擬分子對接，以確定目標蛋白與潛在生物活性成分的結(jié)合親和力。這些生物活性成分與靶蛋白之間的結(jié)合親和力被用作評估標準，結(jié)合親和力越小，結(jié)合能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 射干麻黃湯活性成分及其作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索了射干麻黃湯中各味中藥的化學成分，并通過OB、DL和HL 3個藥代動力學參數(shù)篩選出了射干麻黃湯的93個有效成分，其中麻黃、射干、款冬花和大棗為射干麻黃湯貢獻了多數(shù)活性成分。將射干麻黃湯的93個有效成分依次導入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫共獲得84個有效成分的3 263個靶點，去重復后得到465個有效成分作用靶點。

2.2 C-T-D網(wǎng)絡構(gòu)建及關鍵活性成分

在Gene cards數(shù)據(jù)庫中1 475個靶點被篩選為哮喘的治療靶點，這些靶點與有效成分作用靶點取交集得有效成分治療哮喘的靶點。將有效成分、有效成分治療哮喘的靶點和哮喘導入Cytoscape構(gòu)建了C-T-D網(wǎng)絡圖進行可視化（圖1），該網(wǎng)絡圖是由169個節(jié)點和1 009條邊構(gòu)成，其中包含哮喘、99個有效成分治療哮喘的靶點和69個有效成分，將有效成分節(jié)點的大小按照其連接度大小繪制，并篩選出消旋卡文定堿、黃芩素及白藜蘆醇等22個治療哮喘的關鍵活性成分，詳細信息見表1。

圖1 活性成分-靶點-哮喘（C-T-D）網(wǎng)絡圖Fig.1 The active ingredient-target-asthma(C-T-D)network diagram

表1 射干麻黃湯治療哮喘關鍵活性成分Table 1 Active ingredients for various medicinal materials of Shegan Mahuang Decoction

續(xù)表

2.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建及關鍵靶點

利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建射干麻黃湯治療哮喘靶點的PPI網(wǎng)絡，隨后將關鍵活性成分映射在PPI網(wǎng)絡圖中構(gòu)建“關鍵活性成分-PPI網(wǎng)絡圖”（圖2），根據(jù)靶點連接度的大小篩選出前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin H Synthase-2,Ptgs2）、過氧化物酶體增生激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,Pparg）、腺苷A1受體（adenosine A1 receptorAdora1）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（protein kinase B,Akt1）等15個射干麻黃湯治療哮喘的關鍵靶點。

圖2 射干麻黃湯治療哮喘的關鍵活性成分-PPI網(wǎng)絡圖Fig.2 The key active ingredients of Shegan Mahuang Decoction in the treatment of the asthma-PPI network diagram

2.4 功能富集和作用通路富集

將PPI網(wǎng)絡圖中的射干麻黃湯治療哮喘的靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“大鼠”，以P＜0.05為條件，進行KEGGPathway、BP、CC和MF分析。如圖3 A所示，這些靶點主要參與胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、炎癥反應和腺苷酸環(huán)化酶活性的負調(diào)節(jié)等生物學過程；細胞組成為質(zhì)膜、軸突末端和神經(jīng)元胞體等；主要發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)腺苷受體活性、腎上腺素結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活性和花生四烯酸15-脂肪氧化酶活性等細胞功能。如圖2所示，這些靶點主要參與鈣信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）信號通路、色氨酸（tryptophan,TRP）通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）-蛋白激酶G（protein kinase G,PKG）信號通路、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號通路和磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）信號通路等。推測射干麻黃湯中消旋卡文定堿、黃芩素和白藜蘆醇等22個治療哮喘的關鍵活性成分通過Ptgs2、Adora1、Pparg和Akt1等15個靶點參與上述信號通路中發(fā)揮治療哮喘的作用。

圖3 射干麻黃湯作用靶點的：生物學過程、細胞組成、分子功能富集（A）；KEGG Pathway富集分析（B）Fig.3 The target of Shegan Mahuang Decoction:biological process,cell composition,molecular function enrichment(A);KEGG Pathway enrichment analysis(B)

2.5 分子對接

選取射干麻黃湯治療哮喘的關鍵活性成分-PPI網(wǎng)絡圖中連接度前四名的靶點進行分子模擬，如表1所示，首先分別選取靶點的陽性藥進行分子對接，獲取各自陽性藥與靶點的親和能力，隨后將射干麻黃湯中22個關鍵活性成分的mol2格式的結(jié)構(gòu)文件放入到Auto-DockTool程序中進行分子模擬，結(jié)果顯示關鍵成分均能與轉(zhuǎn)位因子蛋白（translocator protein,Tspo）、Ptgs2、Pparg和Adora1進行結(jié)合，其中消旋卡文定堿與Adoral、Ptgs2和Tspo靶點的結(jié)合能力大于陽性藥，anhydrobelachinal和epianhydrobelachinal與Ppary的結(jié)合能力最強，其中消旋卡文定堿展現(xiàn)出極強的結(jié)合能力，提示該化合物在治療哮喘中發(fā)揮重要作用。

表2 射干麻黃湯關鍵活性成分與關鍵蛋白進行結(jié)合能力Table 2 The binding ability of key active ingredients of Shegan Mahuang Decoction and key proteins

3 討論

TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索了射干麻黃湯中各味中藥的化學成分，并通過藥代動力學參數(shù)篩選出93個有效成分，通過構(gòu)建C-T-D網(wǎng)絡圖篩選出消旋卡文定堿、黃芩素和白藜蘆醇等22個治療哮喘的關鍵活性成分。已證明消旋卡文定堿可抑制促炎細胞因子、腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-,TNF-）和白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的產(chǎn)生以及NF-B信號通路的激活，進而預防和治療肺部炎癥疾病[13]。黃芩素可通過調(diào)節(jié)輔助性T細胞1（Th1）/輔助性T細胞2（Th2）細胞因子失衡和肥大細胞釋放組胺來治療過敏性哮喘[14]。白藜蘆醇可減輕哮喘導致的氣道炎癥和氣道重塑[15]，可調(diào)控過敏性哮喘小鼠熱休克因子1（heatshockfactor1，HSF1）與腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的表達，進而降低哮喘引發(fā)的炎性反應及氣道高阻力，減輕肺組織損傷[16,17]，白藜蘆醇能夠減少哮喘發(fā)作產(chǎn)生的氣道黏液，減輕發(fā)作癥狀[18]。

通過網(wǎng)絡分析和分子對接研究表明，射干麻黃湯的藥效物質(zhì)中的22個關鍵活性成分是通過Ptgs2、Adora1、Pparg和Akt1等靶點發(fā)揮治療哮喘的作用。在哮喘氣道中，Adora1等受體與腺苷相互作用發(fā)揮抗炎作用[19]。在哮喘患者中，Pparg基因表達與氣道炎癥和重塑反應有關，激活Pparg可下調(diào)Th2型細胞因子的產(chǎn)生和嗜酸性粒細胞功能，減少過敏性哮喘中的肺部炎癥和-干擾素（interferon-,IFN-）、IL-4和IL-2的產(chǎn)生[20]。Akt1是PI3K-Akt信號通路中的重要分子，PI3K-Akt信號通路是介導肥大細胞炎癥介質(zhì)和細胞因子分泌的主要通路，在哮喘炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[21]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡藥理學和分子模擬初步確定了射干麻黃湯中22個關鍵活性成分主要作用于15個靶點通過多條途徑治療哮喘，揭示了射干麻黃湯通過“多成分、多靶點和多途徑”治療哮喘的物質(zhì)基礎和作用機制，為射干麻黃湯的進一步開發(fā)利用提供了理論基礎和科學依據(jù)。