人參黃芪片緩解小鼠體力疲勞作用及安全性評價(jià)

任多多，孫印石，李珊珊※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春130118）

現(xiàn)代社會生活和工作壓力大，社會發(fā)展節(jié)奏變快，體力疲勞成為都市人群中非常普遍的現(xiàn)象。當(dāng)體力疲勞持續(xù)時(shí)間長時(shí)，容易引發(fā)注意力不集中、睡眠障礙、肌痛、惡心、頭痛和抑郁等神經(jīng)精神系統(tǒng)癥狀，影響人們的正常工作、學(xué)習(xí)和生活[1]，嚴(yán)重時(shí)還會導(dǎo)致激素紊亂、免疫失調(diào)，甚至器質(zhì)性疾病等。全球約30%的人口有體力疲勞狀況，是非常常見的公共健康問題[2]。臨床上常用于治療體力疲勞的化學(xué)藥物多為大腦皮層興奮藥，副作用較大[3]。中醫(yī)藥調(diào)理疲勞狀態(tài)多以補(bǔ)氣血為主，具有副作用小、功效持久等特點(diǎn)[4]。

人參是我國傳統(tǒng)中藥材，也是最具有長白山特色的植物資源，《本草綱目》將其列為上品。人參中含有豐富的化學(xué)成分[5,6]，具有廣泛的生物活性[7,8]，功效溫和，是人們預(yù)防、治療疾病和滋補(bǔ)健身的佳品。我國衛(wèi)生部于2012年9月發(fā)出公告（2012年第17號），批準(zhǔn)人工種植的人參為新資源食品。目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從細(xì)胞、動物模型及人體等多個(gè)層面證實(shí)了人參的抗疲勞作用[9-11]。黃芪是豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿和生肌等功效[12]。研究表明，黃芪含有多種氨基酸、皂甙、糖類化合物以及葉酸、硒、鋅和銅等[12,13]，具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老和抗菌等作用[14]。人參和黃芪均具有補(bǔ)氣作用，人參具有大補(bǔ)元?dú)?、益氣生津及回陽救逆的功效；而黃芪則具有益氣補(bǔ)虛之功效。二者可相輔相成，共同達(dá)到保護(hù)機(jī)體健康目的。人參黃芪片正是以人參和黃芪提取物為主要成分，輔以其他中藥材開發(fā)研制而成。

因此，本研究以人參黃芪片為研究對象，參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中對于功能學(xué)試驗(yàn)的要求，評價(jià)人參黃芪片的緩解體力疲勞功效及安全性。

1 材料和方法

1.1 樣品

人參黃芪片由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動植物加工團(tuán)隊(duì)提供，人口服推薦劑量為2.0 g/d，成人按60 kg體重計(jì)算，折合劑量為0.033 3 g/kg bw。

1.2 主要儀器、器材與試劑

電子天平、722S分光光度計(jì)、水浴箱、游泳箱、振蕩器、AU680貝克曼庫爾特全自動生化分析儀、EKF Lactate scout血乳酸分析儀、冷凍離心機(jī)。尿素試劑盒、肝糖原試劑盒，購自南京建成研究所。

1.3 緩解體力疲勞試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動物分組選取160只體重18～22 g的雄性ICR小鼠，分為I、II、III和IV組，每組40只，分別用于負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、血清尿素、血乳酸和肝糖原測定。隨機(jī)分為對照、低、中、高劑量人參黃芪片小組，每組10只。根據(jù)人體口服推薦量的折合劑量，人參黃芪片低、中、高劑量分別設(shè)為人體推薦劑量的5倍、10倍和30倍，即0.167g/kg bw、0.333g/kg bw和1.000g/kg bw，灌胃給藥30 d，每天1次。對照組給予等體積的蒸餾水。低、中、高組人參黃芪片灌胃樣品配置質(zhì)量濃度分別為16.7mg/mL、33.3 mg/mL和100 mg/mL，每只小鼠根據(jù)體重進(jìn)行灌胃。實(shí)驗(yàn)動物由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)環(huán)境為室內(nèi)溫度22～25℃，濕度46%～50%。

1.3.2 負(fù)重游泳試驗(yàn)于末次給藥30 min后，小鼠尾部負(fù)荷5%體重的鉛皮，置于游泳箱中游泳（水深30 cm，水溫25℃），記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間作為負(fù)重游泳時(shí)間[15,16]（s）。

1.3.3 血清尿素測定于末次給藥30 min后，置于30℃的水中正常游泳90 min，休息1 h后進(jìn)行眼球取血[17]。于4℃下1 500 r/min離心20 min，收集血清。利用全自動生化分析儀測定血清尿素含量。

1.3.4 肝糖原測定采用蒽酮法，于末次給藥30 min后，處死小鼠，取肝臟0.1 g，按試劑盒說明書測定肝糖原含量[15,17]。

1.3.5 血乳酸測定 于末次給藥30 min后，內(nèi)眥靜脈叢采血20L，再將小鼠置于30℃的水中游泳10 min，分別在運(yùn)動后0 min和20 min于內(nèi)眥靜脈叢采血20L，按試劑盒說明書測定血乳酸含量，計(jì)算血乳酸曲線下面積[15,18]。血乳酸曲線下面積=1/2（游泳前血乳酸值+游泳后0 min的血乳酸值）10+1/2（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）20[18]。

1.4 小鼠急性毒性試驗(yàn)

取20只體重為18～22 g的昆明小鼠，雌雄各半，每間隔4 h灌胃2次，灌胃體積0.2 mL/10 g bw，累積劑量20 g/kg bw。灌胃前禁食16 h，灌胃后連續(xù)觀察2周，記錄中毒及死亡情況[19,20]。

1.5 Ames試驗(yàn)

采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100和TA102四株菌株進(jìn)行試驗(yàn)[19,21-23]。采用多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶（S9）作為體外代謝活化系統(tǒng)。試驗(yàn)設(shè)5 000g/皿、1 000g/皿、200g/皿、40g/皿、8g/皿5個(gè)劑量。同時(shí)設(shè)溶劑對照、自發(fā)回變和陽性突變劑對照。稱樣品1.25 g，加入蒸餾水定容至25 mL，其濃度為50 mg/mL，以此液為原液，配成10 mg/mL、2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.08 mg/mL濃度組，高壓蒸汽滅菌后備用。試驗(yàn)時(shí)，在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL受試物溶液和0.5 mL S9混合液（當(dāng)需要代謝活化時(shí)），混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿菌落數(shù)。如果受試物的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上并有劑量-反應(yīng)關(guān)系者則定為陽性[23]。試驗(yàn)時(shí)，計(jì)數(shù)每皿菌落數(shù)，重復(fù)兩次。

1.6 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[19,21-24]中的方法，取50只體重為25～30 g的昆明小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只，蒸餾水為陰性對照，環(huán)磷酰胺為陽性對照，試驗(yàn)組高、中、低劑量分別為10 g/kg bw、5 g/kg bw、2.5g/kg bw，末次給藥后解剖，取胸骨骨髓，涂片，固定，Giemsa染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算[24]。

1.7 小鼠精子畸形試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[23,24]中的方法，取25只體重25～35 g的雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為5組，每組5只，蒸餾水為陰性對照，環(huán)磷酰胺為陽性對照，試驗(yàn)組高、中、低劑量分別為10 g/kg bw、5 g/kg bw、2.5 g/kg bw，末次給藥后第30天解剖，取副睪涂片，伊紅染色，計(jì)算畸變精子發(fā)生率[24]。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)間有顯著差異。

1.9 結(jié)果判定

血清尿素、肝糖原和血乳酸三項(xiàng)指標(biāo)中任二項(xiàng)陽性，且負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果陽性，可判定人參黃芪片具有緩解體力疲勞功效[15,18]。急性毒性試驗(yàn)中產(chǎn)品對動物無明顯中毒情況，對臟器指標(biāo)無影響，可視為無毒級。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參黃芪片對小鼠體重的影響

體重是反映小鼠身體機(jī)能的最直觀的數(shù)據(jù)。本研究中，共有4組小鼠被用于進(jìn)行不同指標(biāo)的檢測。表1～表4記錄了各組小鼠的各階段體重及體重增重情況。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對照組相比，各組小鼠實(shí)驗(yàn)不同階段的體重及增重情況均無顯著差異（P＞0.05），說明人參黃芪片對于小鼠的體重?zé)o顯著影響，符合緩解體力疲勞功能實(shí)驗(yàn)對動物的要求。

表1 人參黃芪片對小鼠體重的影響（Ⅰ組：負(fù)重游泳）Table 1 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group I:load swimming)

表2 人參黃芪片對小鼠體重的影響（Ⅱ組：血清尿素測定）Table 2 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group II:serum urea test)

表4 人參黃芪片對小鼠體重的影響（Ⅳ組：肝糖原含量測定）Table 4 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group IV:Hepatic glycongen content)

表3 人參黃芪片對小鼠體重的影響（Ⅲ組：血乳酸測定）Table 3 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group III:Blood lactic acid content)

2.2 人參黃芪片對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

負(fù)重游泳時(shí)間是疲勞小鼠模型中常用于衡量運(yùn)動耐力的指標(biāo)，也是小鼠肌肉運(yùn)動能力的直觀參數(shù)，負(fù)重游泳時(shí)間越長，小鼠抗運(yùn)動疲勞的能力越強(qiáng)[25]。因此，該時(shí)間的長短可以反映小鼠抵抗疲勞能力的強(qiáng)弱。與對照組相比（表5），人參黃芪片高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長（P＜0.05），而低劑量組和中劑量組則無顯著影響（P＞0.05）。

表5 人參黃芪片對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table 5 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the weight-loaded swimming time in mice

2.3 人參黃芪片對小鼠血清尿素的影響

血清尿素與小鼠的疲勞程度、運(yùn)動適應(yīng)性以及負(fù)荷量密切相關(guān)，是評定疲勞程度的常用指標(biāo)[26]。通常，當(dāng)運(yùn)動負(fù)荷增加時(shí)，血清尿素含量也相應(yīng)增加。血清尿素水平越高，則表明機(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷的適應(yīng)能力越差，小鼠越疲勞；反之，血清尿素水平越低，機(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷的適應(yīng)能力越強(qiáng)，小鼠抗疲勞的能力也越強(qiáng)。與對照組相比，給予人參黃芪片低劑量和中劑量時(shí)，能夠降低小鼠的血清尿素水平（表6），但差異不顯著（P＞0.05）；高劑量組可顯著降低小鼠血清尿素水平（P＜0.05），具有一定的抗疲勞作用。

表6 人參黃芪片對疲勞小鼠血清尿素的影響Table 6 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the serum urea in mice

2.4 人參黃芪片對運(yùn)動后小鼠血乳酸變化的影響

運(yùn)動過程中，糖酵解產(chǎn)生的乳酸容易在肌肉組織中累積。降低血乳酸的累積，能夠有效緩解疲勞的發(fā)生，提高機(jī)體抗疲勞的能力[25]。人參黃芪片各劑量組小鼠的血乳酸曲線下面積與對照組比較（表7）差異均不顯著（P＞0.05），提示人參黃芪片可能通過其他途徑達(dá)到抗體力疲勞的效果。

表7 人參黃芪片對小鼠血乳酸變化的影響Table 7 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the blood lactic acid in mice

2.5 人參黃芪片對小鼠肝糖原儲備量的影響

肝糖原是哺乳動物體內(nèi)非常重要的能量物質(zhì)，其儲備量對機(jī)體的運(yùn)動能力以及疲勞出現(xiàn)的速度和程度都有重要的影響[27]。肝糖原儲備量增加，有助于提高小鼠的運(yùn)動能力和耐力，進(jìn)而達(dá)到抗疲勞的效果[27]。與對照組相比，人參黃芪片低劑量組和中劑量組能夠增加肝組織中肝糖原的含量（表8），但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量組小鼠的肝糖原儲備量明顯高于對照組，且差異顯著（P＜0.05）。

表8 人參黃芪片對小鼠肝糖原儲備量的影響Table 8 Effects of Renshenhuangqi Tablets on liver glycogen reserve in mice

2.6 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

由表9可見，以20 g/kg bw劑量的人參黃芪片灌胃給雌雄昆明小鼠后，無明顯中毒癥狀，觀察14 d無死亡[19,22]。觀察期末解剖小鼠，未見心、肝、脾、肺、腎和腸胃等主要臟器組織明顯異常[22]。人參黃芪片對小鼠的最大耐受劑量大于20 g/kg bw，根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，屬無毒級。

表9 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)小鼠體重及死亡數(shù)情況Table 9 Weight and death amounts of mice during acute oral toxicity test

2.7 Ames試驗(yàn)

陽性對照[28]：TA97a+S9、TA98+S9和TA100+S9采用2-AF（劑量：10.0g/皿）；TA97a-S9和TA98-S9采用9-芴酮（劑量：0.2g/皿）；TA100-S9采用NaN3（劑量：1.5g/皿）；TA102+S9采用1,8-二羥蒽醌（劑量：50.0g/皿）；TA102-S9采用MMC（劑量：0.5g/皿）。表10和表11同。

表10 人參黃芪片Ames試驗(yàn)結(jié)果（第1次）（±s）Table 10 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(first times)(±s)

表10 人參黃芪片Ames試驗(yàn)結(jié)果（第1次）（±s）Table 10 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(first times)(±s)

受試物Subject劑量（g/皿）Dose TA97a TA98 TA100 TA102+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9受試物5 000 116.0±11.4 121.0±10.4 33.7±6.4 33.0±4.4 137.3±11.1 159.3±18.1 286.3±11.7 267.7±15.1 1 000 121.7±13.7 115.3±10.1 37.7±3.1 32.3±4.0 164.0±14.5 141.7±21.1 287.3±10.7 270.0±22.3 120.0±12.1 115.7±14.0 40.7±5.0 34.3±5.8 152.7±21.5 158.3±14.7 276.3±11.9 266.0±14.9 200 40 117.0±11.5 118.7±11.4 39.3±6.1 35.3±6.1 137.7±15.0 149.3±17.5 288.0±23.3 269.0±18.5 8 119.3±12.9 118.3±10.4 35.0±4.0 35.7±5.1 144.0±13.1 150.3±21.1 279.0±16.5 269.3±17.1自發(fā)回變 116.7±11.2 112.7±11.6 38.3±5.5 34.7±6.4 146.3±15.9 144.3±13.9 281.3±23.3 279.3±21.6溶劑對照 117.7±10.5 115.0±11.1 39.7±6.4 33.3±3.1 145.7±20.1 150.7±22.5 272.3±18.0 265.0±23.0陽性對照 1 302.0±128.3 1 292.3±101.5 2 527.0±165.3 2 266.7±133.3 2 559.7±167.9 2 427.3±115.7 1 046.0±162.8 2 257.3±137.0

表11 人參黃芪片Ames試驗(yàn)結(jié)果（第2次）（±s）Table 11 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(second times)(±s)

表11 人參黃芪片Ames試驗(yàn)結(jié)果（第2次）（±s）Table 11 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(second times)(±s)

受試物Subject劑量（g/皿）Dose TA97a TA98 TA100 TA102+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9受試物5 000 115.0±10.8 116.7±10.6 38.0±5.3 36.3±4.0 146.3±17.2 165.7±11.7 277.3±11.7 272.0±11.5 1 000 113.0±18.7 114.0±14.8 34.7±4.2 34.3±3.8 147.0±10.8 140.3±10.1 283.3±16.2 270.3±23.7 200 117.0±12.5 110.3±14.5 37.3±3.2 37.0±4.4 156.7±11.7 150.0±13.7 289.0±21.2 262.7±11.9 40 121.0±19.3 119.7±14.2 38.7±3.1 36.7±3.1 145.7±12.5 172.0±13.5 280.0±12.8 275.3±13.8 8 116.0±11.4 118.0±13.0 35.3±5.5 36.0±6.0 142.3±15.0 144.7±17.2 290.7±10.2 272.7±25.9自發(fā)回變 112.0±12.8 116.3±19.0 39.3±5.9 35.0±5.0 153.7±14.3 132.7±11.9 282.7±11.2 267.0±19.3溶劑對照 119.3±14.6 107.7±16.9 40.0±3.0 35.7±4.5 137.0±11.1 147.3±18.1 285.3±14.4 264.7±13.1陽性對照 1 289.7±129.4 1 208.3±143.6 2 515.0±133.5 2 237.0±110.5 2 486.3±125.8 2 410.3±165.8 1 070.7±145.5 2 295.7±146.9

由表10及表11可見，對4株試驗(yàn)菌株，加與不加S9，人參黃芪片各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量反應(yīng)關(guān)系。

2.8 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

續(xù)表

由表12可見，人參黃芪片各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），而環(huán)磷酰胺組與陰性對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。人參黃芪片各劑量組PCE/NCE比值未少于陰性對照組的20%，表明人參黃芪片對小鼠骨髓細(xì)胞未見明顯毒性。2.9小鼠精子畸形試驗(yàn)

表12 人參黃芪片對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響Table 12 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the incidence of micronucleus in bone marrow of mice

由表13可見，人參黃芪片各劑量組小鼠精子畸形發(fā)生率與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），而環(huán)磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

表13 人參黃芪片對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響Table 13 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the incidence of sperm abnormalities in mice

疲勞是一種主觀不適感覺，疲勞發(fā)生后如果得不到及時(shí)恢復(fù)，會使機(jī)體發(fā)生激素紊亂、免疫力下降或器質(zhì)性疾病，威脅人類健康[29]。中醫(yī)早在兩千多年前就已開始記載和研究“疲勞”這一現(xiàn)象。許多中草藥可用于治療和緩解疲勞，如人參、黃芪、黃精、西洋參、黨參、何首烏、葛根、山藥、山楂、沙棘、桑葚、麥冬、枸杞子、紅景天、百合、銀杏葉、肉蓯蓉、鹿茸、淫羊藿、巴戟天、鹿角盤、五味子、刺五加和靈芝等[30-36]。中草藥在緩解疲勞方面具有一定的優(yōu)勢，如安全性高，效果明顯，毒副作用小，可通過多靶點(diǎn)多方面緩解疲勞癥狀，而現(xiàn)有的保健食品中，以西洋參和枸杞的使用頻率最高[31]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人參和黃芪中的人參皂苷、人參多糖、黃芪甲苷和黃芪多糖等成分均具有一定的抗疲勞作用[31,37]。人參作為我國傳統(tǒng)中藥材，自古被譽(yù)為“百草之王”，在《本草綱目》中就有記載，具有“大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫”的功效。人參黃芪片就是以人參、黃芪、淫羊藿和巴戟天為主要原料開發(fā)而成的一款具有緩解體力疲勞的保健食品。按照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中的規(guī)定與要求，證實(shí)了該人參黃芪片的緩解體力疲勞功效和安全性，但還有許多工作需要補(bǔ)充和完善，如產(chǎn)品的生理生化指標(biāo)檢測、衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)等等，這些都將在今后的工作中逐步進(jìn)行?？傊?，雖然人參、黃芪、淫羊藿、巴戟天或其他中草藥對于緩解體力疲勞的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但我們的研究結(jié)果可以為類似研究提供一些數(shù)據(jù)和理論參考。

3 結(jié)論

根據(jù)人參黃芪片人體口服推薦量（0.0333g/kg bw）的折合劑量，該產(chǎn)品在小鼠實(shí)驗(yàn)中的給藥低、中、高劑量分別設(shè)為人體推薦劑量的5倍、10倍和30倍，即0.167 g/kg bw、0.333 g/kg bw和1.000 g/kg bw。經(jīng)口給予小鼠人參黃芪片30 d后，小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長，肝糖原儲備量顯著增加，運(yùn)動后血清尿素水平顯著降低；急性毒性試驗(yàn)中產(chǎn)品使用無明顯動物中毒情況，對臟器指標(biāo)無影響，3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版），該產(chǎn)品具有緩解體力疲勞的功效，且屬于無毒級。