常壓蒸汽處理對全麥粉脂肪相關(guān)酶活性及微生物的影響

杜昱蒙，任國寶，任晨剛,4，陳 潛，甘婉強(qiáng)，陳 艷?

（1. 中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 102209；2. 新希望六和股份有限公司，北京 100020；3. 中糧海嘉（廈門）面業(yè)有限公司，福建 廈門 361000；4. 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室（北京市科委），北京 102209）

全麥粉含有豐富的維生素、膳食纖維及多種微量元素，越來越受到崇尚健康、綠色、自然的消費(fèi)者的青睞。小麥中的大部分活性脂肪酶（75%～80%）分布在籽粒麩皮中，（20%～25%）分布于胚芽中[1]。小麥籽粒經(jīng)過研磨制備全麥粉時，區(qū)隔麥麩、胚芽、胚乳的區(qū)室被破壞，原本儲藏在胚芽、麩皮細(xì)胞中的脂肪和酶被釋放。諸多研究表明，影響全谷物粉品質(zhì)及貨架期穩(wěn)定性的最關(guān)鍵因素為脂肪的分解及氧化[2]。低溫貯藏可以有效減緩脂肪的分解速度，在-20 ℃條件下貯藏20周的全麥粉幾乎未發(fā)生脂肪分解，但冷鏈運(yùn)輸及貯藏的成本過高，難以大范圍應(yīng)用[3]。也有學(xué)者通過氣調(diào)包裝和在包裝中加入抗氧化劑等措施延緩脂肪分解，但收效甚微，原因是脂肪水解酸敗是酶促反應(yīng)，并不受環(huán)境中的氧氣含量的影響[4]，而游離脂肪酸的氧化速度過快，導(dǎo)致抗氧化劑無法及時起效。因此，提高全谷物粉穩(wěn)定性的最佳方法是抑制脂肪酶及脂肪氧化酶的活性。

對此，國內(nèi)外有大量的相關(guān)研究報道。目前，應(yīng)用比較廣泛的滅酶工藝包括：熱處理（干熱或濕熱），微波處理，擠壓處理等[5]。其中，使用蒸汽處理鈍化脂肪酶及脂肪氧化酶的研究較為廣泛，蒸汽處理可大致分為過熱蒸汽和常壓蒸汽處理。過熱蒸汽處理小麥籽粒，顯著減少了全麥粉中脂肪酶、脂氧合酶以及多酚氧化酶的活性[6]。但是，使用過熱蒸汽處理麩皮會在一定程度上改變麩皮的微觀結(jié)構(gòu)和面團(tuán)的流變特性，從而對全麥粉的應(yīng)用品質(zhì)產(chǎn)生一定程度的影響[7-8]。另一方面，過熱蒸汽處理對于設(shè)備及操作人員的專業(yè)性要求較高，對于生產(chǎn)企業(yè)負(fù)擔(dān)較大。對麩皮進(jìn)行常壓蒸汽處理是抑制全麥粉微生物含量及酶活性最為經(jīng)濟(jì)、有效的手段之一。同時，常壓蒸汽處理[9]對于維持麩皮形態(tài)、色澤等方面也存在一定的積極意義，可以作為穩(wěn)態(tài)化全麥粉生產(chǎn)的常規(guī)處理方法之一。

全麥粉中的微生物也是影響全麥粉貨架期的重要因素。目前，小麥粉國標(biāo)中尚未有微生物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但許多食品企業(yè)已經(jīng)開始逐步建立衛(wèi)生相關(guān)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。小麥中的微生物主要集中在小麥籽粒的表面，seiler 等報道[10]，小麥的菌落總數(shù)（6.4 log CFU/g）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于面粉的菌落總數(shù)（1.9 log CFU/g），小麥的霉菌（4.3 log CFU/g）為面粉霉菌（3.7 log CFU/g）的2倍。楊少武的研究表明，各系統(tǒng)粉嗜溫芽孢菌含量也存在較大差異，接近表皮部分嗜溫芽孢菌含量較中心胚乳部分含量高[11]。未經(jīng)任何處理的全麥粉微生物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通面粉，也會對后續(xù)產(chǎn)品的生產(chǎn)造成較大的威脅。

因此，本研究評估了不同常壓蒸汽處理強(qiáng)度對麩皮微生物及酶活的影響，并綜合評價蒸汽處理麩皮制備的穩(wěn)態(tài)化全麥粉保質(zhì)期，為工業(yè)化生產(chǎn)穩(wěn)態(tài)化全麥粉提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

國產(chǎn)全麥粉Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（金山全麥粉：益海嘉里(昆山)食品工業(yè)有限公司；孖叁牌全麥粉：肇慶市福加德面粉有限公司；一風(fēng)吹全麥粉：河南金苑糧油有限公司）；進(jìn)口紅磨坊全麥粉：美國鮑勃紅磨坊；硬紅春麥，2019年9月收獲，2020年1月到港后取樣在恒溫樣品庫中儲藏（23 ℃，RH60%）：加拿大西部；氫氧化鈉、無水乙醇、乙醇（95%）、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞（99%）、濃硫酸、丙酮、石油醚（沸程 30～60 ℃）（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小型實驗?zāi)シ蹤C(jī)（Quadrumat Junior）：德國布拉班德儀器設(shè)備有限公司；全自動旋風(fēng)磨（M3100）：波通瑞華科學(xué)儀器（北京）有限公司；Titrette?數(shù)字瓶口滴定器：德國普蘭德公司；分光光度計（UV-4802）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；激光粒度儀（Mastersizer 3000）：英國馬爾文公司；醫(yī)用臺式離心機(jī)（TDZ5-WS）：長沙平凡儀器儀表有限公司；多功能蒸汽鍋（10L，WSYH26A）：美的集團(tuán)股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 全籽粒全麥粉制備

使用小型實驗?zāi)シ蹤C(jī)將小麥籽粒研磨成粉，并分離胚乳及麩皮，得到出率70%面粉及30%麩皮（含粉）。再使用全自動旋風(fēng)磨粉機(jī)對麩皮進(jìn)行研磨（篩片孔徑 0.8 mm），使所有麩皮粉可通過80目篩，再將麩皮粉和出率為70%的自制面粉混合，得到全籽粒全麥粉。

1.3.2 穩(wěn)態(tài)化麩皮粉及全麥粉制備

穩(wěn)態(tài)化麩皮粉：使用小型實驗?zāi)シ蹤C(jī)將小麥籽粒研磨成粉，并分離胚乳及麩皮，得到出率70%面粉及30%麩皮。將蒸汽鍋中水加熱煮沸，取150 g麩皮鋪于篩網(wǎng)上（篩面30 cm×30 cm），將篩網(wǎng)放在蒸汽鍋上方分別加熱指定時間，加熱后麩皮放入烘箱中，80 ℃烘干，將麩皮水分烘干至11%～12%，再使用全自動旋風(fēng)磨粉機(jī)對麩皮進(jìn)行研磨（篩片孔徑 0.8 mm），使所有麩皮粉可通過80目篩。

穩(wěn)態(tài)化全麥粉：將穩(wěn)態(tài)化處理后的麩皮粉按30%的比例與出粉率 70%的面粉混合后，制成穩(wěn)態(tài)化全麥粉。

1.3.3 粒徑測量

使用馬爾文Mastersizer 3000激光粒度儀，采用干法粒徑測試系統(tǒng)。參數(shù)：氣壓：1.5 bar；進(jìn)樣速度：40%；折射率：1.59；顆粒密度：1.05 g/m3；測量次數(shù)：1；背景測量持續(xù)時間：10 s；樣品測量持續(xù)時間：20 s；背景穩(wěn)定時間：120 s。

1.3.4 脂肪酸值測定

脂肪酸值參考GB/T 15684—2015《谷物碾磨制品 脂肪酸值的測定》測定。

1.3.5 脂肪酶活性測定

脂肪酶活性測定參考 Domenico R等報道[12]的方法；使用磷酸鹽緩沖液配制（pH7.5，0.2 mol/L）配制10.75 mMp-硝基苯丁酸酯溶液，稱量麩皮樣品0.02 g和9 mL磷酸鹽緩沖液于試管中，加入1 mLp-硝基苯丁酸酯溶液，混勻后，25 ℃水浴20 min，1 000 r/min 離心 5 min，在加入p-硝基苯丁酸酯溶液后的30 min取上清測試其在400 nm處的吸光值。使用對硝基苯酚做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算p-硝基苯丁酸酯的氧化情況，從而評估脂肪酶活性。

1.3.6 脂肪氧化酶活測定

脂肪氧化酶活測定參考Cato L等報道[13]的方法。酶提取液：將 2 g樣品和 10 mL緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5 磷酸緩沖液）混合，冰水浴提取 30 min，4 ℃，3 000 r/min 離心 20 min，取上清液。

底物配制：0.125 mL吐溫20分散于2.5 mL，pH 9.0的0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液中，搖動下逐滴加入0.150 mL的亞油酸，充分混勻使亞油酸的微細(xì)狀體分散于液體中，加入1 mol/L氫氧化鈉0.325 mL搖動使體系成為清澈透明的溶液，然后加入硼酸鹽緩沖液22.5 mL，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至7.0，用清水定容至50 mL。

分別加 0.5 mol/L，pH5.5乙酸鹽緩沖液3.86 mL，提取酶液 20 μL，底物 120 μL 于試管中，混合均勻，于234 nm處，記錄吸光值，3 min后再次記錄吸光值。

酶活的定義：在20 ℃，234 nm處，以亞油酸為底物時，反應(yīng)體系每分鐘增加吸光度 0.001為一個活力單位。

1.3.7 全麥粉的保質(zhì)期測試

采用鋁箔袋包裝（每包 30 g），對全麥粉進(jìn)行長期穩(wěn)定性試驗和加速破壞性試驗[14]，以脂肪酸值為評價指標(biāo)。長期穩(wěn)定性試驗的樣品在常溫（25±1）℃、濕度50%的條件下進(jìn)行，取樣間隔30 d。加速破壞性試驗溫度為 35、45 ℃，濕度 50%。其中，35 ℃貯藏樣品取樣時間間隔為 15 d、45 ℃為 8 d。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) LS/T 3244—2015《全麥粉》規(guī)定，以全麥粉的脂肪酸值（以干基 KOH計）達(dá)到116 mg/100g時的日期作為保質(zhì)期參考限。

1.3.8 微生物檢測方法

菌落總數(shù)：參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)》測定；

霉菌：參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》測定；

大腸菌群：參考GB 4789.3—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》測定；

總芽孢桿菌：與菌落總數(shù)測定方法相同，需增加在制備完成1∶10的樣品勻液后，將其放置于試管中，在80 ℃水浴條件下加熱10 min，并使用冷卻后的樣品勻液進(jìn)行后續(xù)的測試，計數(shù)與結(jié)果統(tǒng)計方法均與GB 4789.2—2016相同。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用 SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。部分結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，指標(biāo)內(nèi)部的均值比較采用單因素方差分析，多重比較采用鄧肯法，采用95%置信度（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售全麥粉貨架期關(guān)鍵指標(biāo)對比

選取四款市售全麥粉與自制全麥粉的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行對比。其中，有三款國產(chǎn)全麥粉、一款進(jìn)口全麥粉，國產(chǎn)全麥粉的膳食纖維均在10%～11%的范圍內(nèi)，樣品間膳食纖維含量差別不顯著，進(jìn)口全麥粉膳食纖維含量為 15.6%，明顯高于國內(nèi)全麥粉的平均水平。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 3244—2015《全麥粉》規(guī)定，理化指標(biāo)應(yīng)符合總膳食纖維≥9.0%，表1中的市售及自制全籽粒全麥粉均符合全麥粉關(guān)鍵指標(biāo)的要求。市售四款全麥粉的粒徑差異較明顯，其中國產(chǎn)全麥粉Ⅱ粒徑最大，其次為國產(chǎn)全麥粉Ⅰ和國產(chǎn)全麥粉Ⅲ，其中進(jìn)口全麥粉和自制全籽粒全麥粉的粒徑最小。

表1 市售及自制全麥粉膳食纖維及粒徑分析Table 1 Dietary fiber content and particle size distribution of the whole wheat flour samples

限制全麥粉貨架期的主要問題是酸敗和哈敗，其中起到關(guān)鍵性作用的兩種物質(zhì)為脂肪酶和脂肪氧化酶，表1～2結(jié)果顯示，市售及自制全麥粉經(jīng)過3個月相同條件儲藏后，其脂肪酸值均處于較高水平，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 3244—2015《全麥粉》規(guī)定，全麥粉脂肪酸值（以干基 KOH計）≤116 mg/100g。在貯藏3個月后，全麥粉的脂肪酸值均高于標(biāo)準(zhǔn)要求或處于臨界值附近。這與前期的研究結(jié)果一致[15]。

表2 市售及自制全麥粉脂肪酶系及脂肪酸值Table 2 Fatty acid value and enzyme activity of the whole wheat flour samples

另一方面，全麥粉的微生物含量較高，且含有大量不易被殺死的芽孢，這也間接導(dǎo)致全麥制品中菌落總數(shù)超標(biāo)的問題。因此，在全麥粉生產(chǎn)過程中，微生物含量也是影響全麥粉應(yīng)用品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。

如表3所示，國產(chǎn)全麥粉Ⅰ和國產(chǎn)全麥粉Ⅱ的菌落總數(shù)較高，分別為8.0×103CFU/g和1.0×104CFU/g，國產(chǎn)全麥粉Ⅲ和自制全籽粒全麥粉的菌落總數(shù)較低，分別為 9.5×103CFU/g和 4.0×103CFU/g。進(jìn)口全麥粉的菌落總數(shù)含量較低，為8×102CFU/g。其中，進(jìn)口全麥粉的霉菌含量最低，為10 CFU/g，國產(chǎn)全麥粉Ⅱ的霉菌總數(shù)90 CFU/g，其他全麥粉的霉菌含量為2.6～7.3×102CFU/g，進(jìn)口小麥粉總芽孢數(shù)較低，為15 CFU/g，除國產(chǎn)全麥粉Ⅰ號外，其他國產(chǎn)全麥粉和自制全麥粉芽孢含量較高，為1.8～3.5×102CFU/g，其結(jié)果基本與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。研究表明，小麥籽粒中芽孢含量超過4.3 log CFU/g，即會對面包產(chǎn)生不利影響[16]。Berghofer[17]等調(diào)查顯示，澳大利亞小麥粉中細(xì)菌總數(shù) 103CFU/g、芽孢為 102CFU/g、大腸菌群為 10 CFU/g、霉菌和酵母菌的含量為102CFU/g。國內(nèi)部分小麥粉種微生物含量較澳洲小麥粉高，其中菌落總數(shù)在 3.4×103～ 1.8×105CFU/g之間；霉菌含量在 40 ～1.1×103CFU/g 的范圍內(nèi)，其原因推測與國產(chǎn)小麥種植未實現(xiàn)集中種植、收儲和管理，存在微生物控制不嚴(yán)格，品質(zhì)差異大等問題[18]。

表3 市售全麥粉微生物情況Table 3 Microbiological condition of the whole wheat flour samples CFU/g

2.2 常壓蒸汽處理對麩皮微生物及脂肪酶活的影響

如表4所示，將麩皮部分分別進(jìn)行5～60 min不同時長的蒸汽處理。結(jié)果表明，麩皮中菌落總數(shù)數(shù)值最大，芽孢其次，霉菌和酵母含量較少，且不耐熱，極易被殺死。經(jīng)過10 min的常壓蒸汽處理后，麩皮中的菌落總數(shù)從2.2×105CFU/g下降至 1.4×102CFU/g，芽孢從 1.2×103CFU/g 下降至 1.1×102CFU/g；常壓蒸汽處理 20 min 后，菌落總數(shù)和芽孢均降至100 CFU/g以下，達(dá)到較低水平。

表4 不同汽蒸時間處理麩皮的微生物情況Table 4 Microbiological condition of the bran with steam treatment in different time CFU/g

由于小麥、燕麥等籽粒的脂肪酶主要集中在麩皮部分，因此，可以采用先分離出麩皮部分進(jìn)行單獨(dú)的滅酶處理，再將麩皮回添至面粉中的方法制備全谷物粉，Rose（2008）報道，使用微波（1 000 W）和蒸汽（60 s）處理麩皮，其脂肪酶活性分別減少了93%和96%[19]。脂肪酶和脂肪氧化酶對于熱處理較為敏感，實驗結(jié)果如圖1所示，常壓蒸汽處理5 min以上，脂肪酶失活率可達(dá)90%以上，脂肪氧化酶在常壓蒸汽處理10 min后失活率可達(dá)80%以上。

圖1 不同汽蒸時間處理麩皮脂肪相關(guān)酶鈍化情況Fig.1 Passivation rate of the lipase and lipoxygenase in bran with steam treatment in different times

2.3 穩(wěn)態(tài)化全麥粉貨架期測試

基于上述麩皮處理結(jié)果，選取蒸汽處理10 min的麩皮粉與自制的出率70%的面粉混合，制成穩(wěn)態(tài)化全麥粉，并對其進(jìn)行貨架期評價。實驗結(jié)果如表5和圖2所示，經(jīng)過穩(wěn)態(tài)化處理后的全麥粉菌落總數(shù)降低至1 000以下，脂肪酶及脂肪氧化酶活性降低60%以上。

表5 穩(wěn)態(tài)化全麥粉微生物情況Table 5 Microbiological condition of stabilized whole wheat flour CFU/g

圖2 穩(wěn)態(tài)化全麥粉粉脂肪相關(guān)酶活性Fig.2 Enzyme activity of stabilized whole wheat flour samples

2.3.1 全麥粉貨架期內(nèi)菌落總數(shù)測試

對上述全麥粉進(jìn)行貨架期穩(wěn)定性試驗，不同儲藏溫度下穩(wěn)態(tài)化全麥粉菌落總數(shù)變化情況結(jié)果見圖3。

圖3 不同儲藏溫度下穩(wěn)態(tài)化全麥粉菌落總數(shù)變化情況Fig.3 Changes in total plate count of the stabilized whole wheat flour in a long-term storage test

穩(wěn)態(tài)化全麥粉在儲藏期間菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢，貯藏溫度越高，菌落總數(shù)下降越顯著。貯藏120 d后，45 ℃存放全麥粉菌落總數(shù)下降至60 CFU/g，35 ℃存放全麥粉菌落總數(shù)下降至220 CFU/g，25 ℃存放全麥粉菌落總數(shù)下降至750 CFU/g。這主要是由于面粉水分含量較低，不適合微生物的生長和繁殖，尤其是當(dāng)溫度較高的情況下，部分不耐熱的微生物更加難以存活。

2.3.2 全麥粉貨架期內(nèi)脂肪酸值測試

如圖4～6所示，全籽粒全麥粉在25、35、45 ℃條件下的保質(zhì)期（脂肪酸值達(dá)到116 mgKOH/100g）分別為95、51、26 d，根據(jù)食品保質(zhì)期通用指南中的方法計算，其Q10=1.86～1.96，也就是說溫度每升高10 ℃，其保質(zhì)期縮短1.86～1.96倍。穩(wěn)態(tài)化全麥粉在25、35、45 ℃條件下儲藏120 d后，脂肪酸值均未超過 116 mgKOH/100g，因此無法通過超出脂肪酸值限量的日期來判斷其準(zhǔn)確貨架期?；谇捌诘难芯亢臀墨I(xiàn)報道[20]，面粉脂肪酸值隨時間的變化基本成線性，因此對三種儲藏溫度下面粉脂肪酸值上升趨勢曲線進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)其R2均大于0.99。斜率分別為k25=0.077 8；k35=0.158 5；k45=0.327 5。根據(jù)這一趨勢推算出其Q10=2.04～2.07。在 45 ℃條件下存放 120 d 的穩(wěn)態(tài)化全麥粉，脂肪酸值為92.18 mgKOH/100g，按照Q10=2.04～2.07推測，穩(wěn)態(tài)化全麥粉若在25 ℃條件下存放499～514 d（即16～17個月左右），其脂肪酸值為92.18 mgKOH/100 g，未超出標(biāo)準(zhǔn)限量。因此，推測穩(wěn)態(tài)化全麥粉的貨架期至少為16～17個月。

圖4 25 ℃儲藏全麥粉脂肪酸值變化情況Fig.4 Changes in fatty acid value of the whole wheat flours in a long-term storage test (25 ℃)

圖5 35 ℃儲藏全麥粉脂肪酸值變化情況Fig.5 Changes in fatty acid value of the whole wheat flours in a long-term storage test (35 ℃)

圖6 45 ℃儲藏全麥粉脂肪酸值變化情況Fig.6 Changes in fatty acid value of the whole wheat flours in a long-term storage test (45 ℃)

3 結(jié)論

通過前期的市場產(chǎn)品調(diào)研及文獻(xiàn)查閱結(jié)果顯示，與普通面粉相比，全麥粉的微生物情況和脂肪酶等引起的脂肪酸值過高和哈敗等問題是影響其保質(zhì)期的關(guān)鍵因素。通過對微生物和酶含量較高的麩皮部分進(jìn)行蒸汽處理，可有效延長全麥粉貨架期，提升全麥粉的貨架期穩(wěn)定性，極大豐富全麥粉的貯藏及應(yīng)用范圍。結(jié)果表明，麩皮經(jīng)常壓蒸汽處理10 min以上的穩(wěn)態(tài)化全麥粉，菌落總數(shù)從 9.5×103CFU/g 降低至 8.8×102CFU/g，總芽孢數(shù)從 450 CFU/g降低至10 CFU/g，并在不同溫度貯藏期間呈現(xiàn)下降的趨勢。脂肪酶和脂肪氧化酶活性降低60%以上。據(jù)推測，其貨架期至少為16～17個月。