微流控芯片技術(shù)在抗深部真菌感染藥物篩選中的研究進(jìn)展

張曉瑩，朱英霞 綜述 孫慎俠 審校

大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622

深部真菌感染是指致病真菌侵入機(jī)體內(nèi)臟、皮下組織、皮膚角質(zhì)層以下和黏膜所致的感染，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致全身性感染[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類(lèi)的主要深部真菌病原體(白色念珠菌、煙曲霉和新型隱球菌)每年導(dǎo)致超過(guò)200萬(wàn)人感染，150萬(wàn)人死亡[2]。且深部真菌感染的發(fā)生率及死亡率仍呈逐年上升的趨勢(shì)[3]。

對(duì)于許多淺表真菌病，在過(guò)去的一個(gè)世紀(jì)里已經(jīng)研發(fā)了一系列的局部藥物，在控制常見(jiàn)感染方面取得了一定的成功。相比之下，對(duì)于需要全身抗真菌治療的深部真菌病，可用的抗真菌藥物種類(lèi)很少，目前主要有多烯類(lèi)、嘧啶類(lèi)似物、唑類(lèi)和棘白菌素等。但這些藥物存在著靶點(diǎn)少、抗菌譜窄、耐藥性嚴(yán)重、副作用比較大等[4]問(wèn)題。除此之外，抗真菌藥物研發(fā)的進(jìn)程比較緩慢。例如，從2000年到2015年，有18種首創(chuàng)藥物被批準(zhǔn)用于實(shí)體腫瘤癌癥[5]。然而只有一種新的抗真菌藥物—棘白菌素被引入。盡管一些廣泛使用的高通量篩選平臺(tái)可能會(huì)加強(qiáng)藥物篩選進(jìn)程，但它們的成本較高且無(wú)法準(zhǔn)確模擬細(xì)胞藥物間的相互作用，很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)候選藥物對(duì)人體的療效和毒性。因此，構(gòu)建一種既能模擬體內(nèi)環(huán)境并且重復(fù)性高的體外藥物高通量篩選模型具有十分重要的意義。

微流控芯片技術(shù)作為21世紀(jì)最先進(jìn)的分析技術(shù)之一，已經(jīng)成為目前藥物篩選的有力工具。該技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等操作均集成在微米級(jí)的芯片上，可以到代替?zhèn)鹘y(tǒng)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的許多功能[6]。近年來(lái)，該技術(shù)不斷趨于微型化、自動(dòng)化和集成化，并不斷提高分辨率和靈敏度[7]。因此，該技術(shù)的通用性完全符合藥物合成、篩選和測(cè)試的要求[8]。本文就近年來(lái)微流控芯片技術(shù)的發(fā)展及其在抗深部真菌感染藥物篩選中的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景做一綜述。

1 微流控芯片技術(shù)簡(jiǎn)介

微流控芯片分析技術(shù)最早由TERRY等[9]于1979年提出，他利用光刻技術(shù)和化學(xué)蝕刻技術(shù)在硅片上制造了微型氣體分析系統(tǒng)。1990年，MANZ等[10]將高效液相色譜技術(shù)集成在一張微小芯片上，將實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析方法集成到一個(gè)微型化操作系統(tǒng)中，使得多單元技術(shù)可以在微平臺(tái)上靈活組合、大規(guī)模集成。與此同時(shí)，它可以創(chuàng)造可控的微環(huán)境，準(zhǔn)確驅(qū)動(dòng)和控制微流體在微通道中的流動(dòng)，增加檢測(cè)靈敏度，提高檢測(cè)效率[7]。此外，微流控技術(shù)提供了在動(dòng)態(tài)和明確的環(huán)境中研究單個(gè)微生物的方法，并在微生物的檢測(cè)與抗感染方面得到應(yīng)用[11]。因此，利用微流控芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌的深入研究，以達(dá)到更高的效率和精度。

2 傳統(tǒng)抗深部真菌感染藥物篩選方法

目前，常見(jiàn)的抗深部真菌藥物篩選方法主要有體外和體內(nèi)兩種篩選方法。體外篩選實(shí)驗(yàn)以藥敏試驗(yàn)最常用。體內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)主要采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法—以動(dòng)物為模型，預(yù)測(cè)候選藥物對(duì)人體的細(xì)胞毒性、藥代動(dòng)力學(xué)及抗菌效果。

2.1 體外藥敏試驗(yàn)篩選方法 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)藥敏試驗(yàn)(AST)標(biāo)準(zhǔn)，AST可分為瓊脂擴(kuò)散法和稀釋法[12]。通過(guò)這兩種方法可以測(cè)定抗菌素的抑菌圈大小和最小抑菌濃度(MIC)，根據(jù)藥敏分界點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)[13]判斷菌株對(duì)抗菌素的敏感性。瓊脂擴(kuò)散法是一種半定量檢測(cè)方法，通過(guò)抑菌圈的直徑來(lái)判定藥物敏感性。與其他方法相比，瓊脂擴(kuò)散法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，無(wú)需特殊設(shè)備。但此試驗(yàn)僅限于半定量，時(shí)間長(zhǎng)，不能及時(shí)報(bào)出藥敏結(jié)果[13]；藥物濃度、培養(yǎng)基類(lèi)型、溫度、pH值等都對(duì)抑菌圈有一定的影響[14]。稀釋法是一種定量的檢測(cè)方法,分為瓊脂稀釋法和宏量、微量肉湯稀釋法。其中微量肉湯稀釋法被稱為藥敏試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)[14]，其操作步驟已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，能夠經(jīng)濟(jì)、有效、準(zhǔn)確地定量測(cè)定出待檢菌株的MIC。但該方法篩選速度極慢，手工步驟多、試劑消耗大，篩選效率達(dá)不到高通量篩選的要求。除了上述兩種傳統(tǒng)方法外，流式細(xì)胞術(shù)在抗真菌藥物的高通量篩選中發(fā)揮著重要作用[15]，流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)溶液中單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速多參數(shù)分析的技術(shù)。其作用原理是使用細(xì)胞活性標(biāo)記物或熒光染料處理藥物作用后的真菌細(xì)胞，如碘化丙錠(PI)，若細(xì)胞受損而死亡，PI可以進(jìn)入細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞，與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，通過(guò)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)熒光信號(hào)從而判斷細(xì)胞密度和損傷情況。流式細(xì)胞術(shù)操作簡(jiǎn)便、分析迅速，可用于高通量藥物篩選，然而由于侵襲性霉菌菌絲在流式細(xì)胞儀中不易流動(dòng)，故很難用于侵襲性霉菌藥物篩選，常用于酵母型真菌尤其是念珠菌的藥物篩選。以上幾種體外藥敏試驗(yàn)很難滿足對(duì)于嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的藥物篩選，主要原因是這類(lèi)藥物篩選需要考慮突破血腦屏障，有時(shí)通過(guò)體外藥物篩選是有效的，但一旦進(jìn)入臨床體內(nèi)藥效試驗(yàn)就會(huì)出現(xiàn)療效甚微或無(wú)效。

2.2 體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)篩選方法 動(dòng)物試驗(yàn)作為抗深部真菌感染藥物發(fā)現(xiàn)的臨床前試驗(yàn)，在預(yù)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)方面起著非常重要的作用。然而，嚙齒動(dòng)物、狗、猴等與人類(lèi)存在底物特異性、組織分布和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相對(duì)豐富度等方面的差異，這往往導(dǎo)致藥物-藥物相互作用(DDIs)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不準(zhǔn)確或藥代動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，因此一些候選化合物在臨床試驗(yàn)之前就被放棄，大大影響了新藥研發(fā)的效率及成本[16]。此外，整體的動(dòng)物病理模型通常需要手工構(gòu)建，對(duì)技術(shù)的要求較高，這使得動(dòng)物試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，只適合低通量藥物篩選。微流控芯片在藥物研發(fā)中可以模擬人體體內(nèi)組織、器官的生理功能，可以很好地避免動(dòng)物試驗(yàn)帶來(lái)的諸多問(wèn)題，具有極好的重復(fù)性、較高的效率[17-18]。

3 微流控芯片在抗深部真菌感染藥物篩選中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的抗深部真菌藥物篩選方法存在成本高、效率低下等問(wèn)題。盡管一些廣泛使用的高通量篩選平臺(tái)可能會(huì)加強(qiáng)藥物篩選進(jìn)程，但它們的成本較高且無(wú)法準(zhǔn)確模擬細(xì)胞-藥物間的相互作用，因此很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)候選藥物對(duì)人體的療效和毒性。近年來(lái)，微流控技術(shù)的引入大大提高了臨床醫(yī)學(xué)的藥敏試驗(yàn)和耐藥檢測(cè)效率。微流控芯片的抗深部真菌藥物篩選系統(tǒng)主要用于篩選治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的藥物。尤其是新型隱球菌感染引起的腦膜炎。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特殊的血腦屏障(BBB)結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙大部分藥物由血液滲透進(jìn)入腦部。且復(fù)雜的大腦組織結(jié)構(gòu)易結(jié)合藥物，使得許多藥物難以到達(dá)靶向腦組織，極大地削弱了抗真菌藥物的抗菌效果[19]。因此，在抗深部真菌藥物研發(fā)的早期階段就對(duì)藥效指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估至關(guān)重要，特別是評(píng)價(jià)其血腦屏障滲透率和對(duì)靶向腦細(xì)胞的藥效。

近些年來(lái)，一些血腦屏障微流控芯片藥物篩選模型逐漸被研發(fā)出來(lái)，此類(lèi)模型能夠逼真地模擬人體的血液流動(dòng)、血管結(jié)構(gòu)和共培養(yǎng)等生理微環(huán)境[20-21]。實(shí)現(xiàn)檢測(cè)治療CNS疾病的藥物對(duì)血腦屏障的滲透率以及分析藥物對(duì)靶向腦細(xì)胞的毒性。例如，KIM等[22]設(shè)計(jì)了一種BBB芯片用來(lái)測(cè)定某些藥物的血腦屏障滲透率，其結(jié)果與體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果呈現(xiàn)出相關(guān)性。YEON等[23]為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在芯片上形成緊密的內(nèi)皮單層，應(yīng)用具有多孔結(jié)構(gòu)的柵欄結(jié)構(gòu)捕捉內(nèi)皮細(xì)胞，并以星形膠質(zhì)細(xì)胞處理過(guò)的培養(yǎng)基孵育，藥物滲透性試驗(yàn)表明，該模型測(cè)得的滲透性系數(shù)與體內(nèi)模型測(cè)得的腦攝取指數(shù)有一定的相關(guān)性。邵曉劍[24]構(gòu)建的BBB微流控芯片藥物篩選模型主要由BBB模型、三維細(xì)胞培養(yǎng)室、微固相萃取柱芯片組成，結(jié)果表明模型藥物的BBB滲透率以及藥物在腦部組織中的擴(kuò)散和作用效果與體內(nèi)數(shù)據(jù)相似，且整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程只需30 min，樣品量為5μL。這對(duì)研究藥物的滲透率和藥物對(duì)靶向腦細(xì)胞的毒性分析具有重要意義。

與傳統(tǒng)藥物篩選方法相比，微流控芯片中進(jìn)行的藥物處理更敏感，因?yàn)樾酒瑑?nèi)經(jīng)常補(bǔ)充新鮮介質(zhì)和藥物溶液，此外，同一芯片可設(shè)計(jì)不同孔道，實(shí)現(xiàn)不同濃度藥物的同時(shí)給藥。例如，QIANG等[25]設(shè)計(jì)微流控芯片包含成千上萬(wàn)的平行式微通道，微通道寬度從3μL到5μL不等。他們對(duì)50 520種新藥進(jìn)行了篩選，最終發(fā)現(xiàn)10種小分子化合物可以使兩性霉素B對(duì)持久性白色念珠菌的抗感染作用增強(qiáng)30%以上[26-27]。這一發(fā)現(xiàn)可能為臨床治療難治性復(fù)發(fā)的白色念珠菌感染開(kāi)辟了一條新的途徑。BALTEKIN等[28]使用狹窄的微流控阱研究AST，能夠在30 min內(nèi)提供結(jié)果，該方法可以達(dá)到與標(biāo)準(zhǔn)方法相同的效果，但比傳統(tǒng)方法快很多。因此，將微流控技術(shù)引入到臨床醫(yī)學(xué)的藥敏試驗(yàn)和耐藥檢測(cè)中，可以大大提高檢測(cè)效率。

此外，在微流控芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展出了一種新型的液滴微流控藥物篩選平臺(tái)，該技術(shù)采用非連續(xù)流動(dòng)技術(shù)，使不相溶的水油兩相相互作用，快速生成高度單分散的液滴。每個(gè)液滴都可以作為液滴微反應(yīng)器[29]，可同時(shí)開(kāi)展成千上萬(wàn)的反應(yīng)。液滴大小與細(xì)胞大小相似，提供了更生理的、高生物相容性的微環(huán)境[30]。與連續(xù)流微流控芯片相比，液滴微流控芯片可增加通量，易混合，不易交叉污染。與傳統(tǒng)孔板法相比，液滴微流控芯片以液滴包裹真菌作為微反應(yīng)器，不僅可獲得較高的菌落濃度，還大大縮短了真菌的培養(yǎng)時(shí)間[31]。

用液滴微流控芯片篩選抗真菌藥物的基本過(guò)程為：將菌液、藥物、熒光指示劑(在活細(xì)胞中能顯示熒光信號(hào))等一起包裹在液滴中，不同液滴所含藥物濃度不同。通過(guò)檢測(cè)不同液滴內(nèi)的熒光信號(hào)，從而獲得該藥的抗真菌活性[31]。鄭振[29]設(shè)計(jì)了一種液滴微流控芯片用于篩選抗白色念珠菌藥物。他們選取4種抗真菌藥物作為模型藥物，以在活細(xì)胞中具有特殊熒光特性的阿爾瑪藍(lán)作為指示劑，采用96孔微孔板法驗(yàn)證液滴微流控芯片的可行性。結(jié)果表明,液滴微流控芯片平臺(tái)可在2 h內(nèi)準(zhǔn)確、高效地完成抗真菌敏感性測(cè)試。在液滴微流控芯片的基礎(chǔ)上，蔡穎[32]構(gòu)建的濃度梯度液滴微流控芯片，該方法采用液滴微流控技術(shù)結(jié)合濃度梯度生成包裹白色念珠菌的芯片，分別測(cè)試了8種臨床常用抗白色念珠菌藥物的MIC范圍。與普通液滴微流控芯片相比，濃度梯度液滴微流控芯片的優(yōu)勢(shì)在于，一次實(shí)驗(yàn)可以考察多種實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)一步提高了藥物的通量。

4 展望

本文綜述了近年來(lái)用于抗深部真菌感染藥物篩選的微流控芯片研究進(jìn)展。微流控芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和真菌共培養(yǎng)，構(gòu)建高通量、低成本的基于細(xì)胞水平的藥物篩選系統(tǒng)，能夠很好地解決傳統(tǒng)藥物篩選方法帶來(lái)的諸多問(wèn)題。液滴微流控芯片技術(shù)進(jìn)一步發(fā)揮了傳統(tǒng)微流控芯片的優(yōu)勢(shì)，這為抗深部真菌藥物篩選提供了新的試驗(yàn)平臺(tái)。然而目前開(kāi)展的基于液滴微流控芯片的藥物篩選試驗(yàn)尚處于初級(jí)階段，且該技術(shù)在液滴分選、后續(xù)檢測(cè)等方面還存在著一定的局限性。但隨著液滴生成和操控技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來(lái)的液滴微流控技術(shù)必將成為篩選抗深部真菌藥物的有力工具，從而加快藥物研發(fā)進(jìn)程。