凱里地區(qū)辣椒酸細(xì)菌群落多樣性及其乳酸菌分離鑒定

李 潔，崔霖蕓，陳芳勇，宮路路

（遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，貴州 遵義 563000）

辣椒酸又稱為辣椒紅酸湯，是貴州黔東南地區(qū)苗族、侗族等民族常見的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。辣椒酸以辣椒為主要原材料，經(jīng)傳統(tǒng)自然發(fā)酵而成，是制作凱里紅酸湯的半成品；可與番茄紅酸湯按照一定比例混合，經(jīng)二次發(fā)酵便可制成凱里紅酸湯[1]。研究發(fā)現(xiàn)，酸湯具有生津止渴、清熱解毒、健脾開胃和促進(jìn)消化等功能[2]。在黔東南地區(qū)有著“三天不吃酸，走路打串串”的說法[3]。凱里地區(qū)為酸湯主要食用地區(qū)，有著悠久的歷史。2012年，經(jīng)國家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)，“凱里紅酸湯”正式成為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。

目前，酸湯中微生物研究漸漸成為熱點。如酸湯中優(yōu)勢微生物分離[4-5]，酸湯中微生物多樣性分析[6-8]、乳酸菌發(fā)酵酸湯品質(zhì)變化研究[9]，酸湯微生物發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)檢測[10]，酸湯微生物發(fā)酵工藝研究[11-12]，酸湯口服液和飲料產(chǎn)品開發(fā)利用[13-14]、酸湯對高脂血癥大鼠血脂以及腸道影響[13，15]、微生態(tài)制劑對斷奶仔豬腸道微生物影響[16]等。本研究借助發(fā)展成熟的Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對凱里傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒酸及其工業(yè)化成品進(jìn)行研究。利用乳酸菌常用MRS培養(yǎng)基從辣椒酸中篩選優(yōu)勢乳酸菌，以期為研究酸湯發(fā)酵工藝以及酸湯產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5份傳統(tǒng)發(fā)酵成熟階段的辣椒酸樣品：從凱里市東門街農(nóng)貿(mào)市場、金玉農(nóng)貿(mào)市場、開發(fā)區(qū)農(nóng)貿(mào)市場以及鴨塘鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場采集，分別編號為ST8、ST11、ST17、ST23和ST25；某品牌辣椒酸樣品1份（對照）：市售，出廠前已進(jìn)行滅活處理，編號為ST21。每個樣品采集時取30 mL，裝入50 mL無菌離心管，并置于便攜式冰盒中進(jìn)行攜帶。樣品隨即運至昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院應(yīng)用微生物實驗室于4 ℃冰箱暫存待用。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取裂解緩沖液，TE緩沖液[24]；玻璃珠（直徑212～300 mm）：美國Sigma公司；PremixExTaqTM（2×）：日本TaKaRa公司；QIAquick gel Extraction Kit試劑盒：德國Qiangen公司；MRS培養(yǎng)基：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；蔗糖、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、瓊脂糖：上海生工生物工程有限公司；甘油：天津試劑三廠。上述試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-300高壓滅菌鍋：日本TOMY Digital Biology公司；GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SWCJ-1FD超凈工作臺：蘇凈安泰公司；ABI 7200 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Roche_454羅氏GS-FLX測序儀：瑞士Roche公司；Labnet230V EU渦旋儀：美國Labnet公司；SIGMA 3-18K高速離心機：德國Sigma公司；YP1002N電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；ADW-B純水儀：美國艾科浦國際有限公司；GL-3250A磁力攪拌器：麒麟貝爾儀器制造有限公司；Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計：安瑪西亞（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣椒酸樣品細(xì)菌宏基因組DNA提取

稱取辣椒酸樣品500 mg，參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行改良[18]，對樣品細(xì)菌總基因組DNA進(jìn)行提取。將提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA目的基因擴增和高通量測序

使用細(xì)菌16S rDNA通用引物，擴增高變區(qū)V2-V4區(qū)域。引物序列如下：

338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）

806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）

以1.3.1中提取DNA為模板，對細(xì)菌16S rDNA V2-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系：Premix ExTaqTM聚合酶10 μL，模板基因組DNA0.5 μL，目的基因上下游引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）8 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s，循環(huán)30次后；72 ℃延伸5 min。

吸取上述PCR擴增產(chǎn)物5 μL，用去離子水稀釋10倍，按照原反應(yīng)條件進(jìn)行5個循環(huán)，以減少PCR產(chǎn)物的非特異性擴增[19]。PCR產(chǎn)物用QIAquick gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行純化回收，并使用分光光度計定量，使用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序[20]。

1.3.3 測序結(jié)果分類鑒定

根據(jù)barcode將測序序列分配到對應(yīng)樣品中，去除barcode以及引物序列得到有效序列。使用mothur v1.43.1軟件包Miseq SOP進(jìn)行序列拼接，去除質(zhì)量欠佳序列，保留長度大于400 bp的序列。運用mothur v1.43.1軟件classify.seqs命令進(jìn)行分析，結(jié)合Silva的SSU rRNA序列數(shù)據(jù)庫V138分類信息進(jìn)行分析[21]，得到序列分類數(shù)據(jù)。

1.3.4α多樣性指數(shù)分析

使用mothur中classify.seq命令獲得樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)，使用rarefaction.single命令得到微生物Chao1和ACE等指數(shù)。以序列相似度為97%劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。根據(jù)以上結(jié)果計算樣品ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Coverage等。并根據(jù)Rarefaction文件繪制Rarefaction曲線。

1.3.5 辣椒酸中乳酸菌分離

采用倍比稀釋涂布法分離辣椒酸中的乳酸菌。在超凈工作臺中吸取辣椒酸樣品1 mL，經(jīng)無菌生理鹽水梯度稀釋后，吸取20 μL稀釋度為10-6的稀釋液涂布于MRS瓊脂平板表面。待菌液吸收后，將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃靜置培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)菌落形態(tài)，挑取具有不同形狀、大小以及顏色的單菌落進(jìn)行2～3次劃線分離。結(jié)合過氧化氫實驗和革蘭氏染色實驗，選取過氧化氫陰性、革蘭氏染色陽性的菌株，加入30%甘油置于-80 ℃冰箱保存[22]。

1.3.6 辣椒酸中乳酸菌分子生物學(xué)鑒定

以改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取1.3.5中分離到的乳酸菌基因組DNA，利用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴增。

引物序列：F27（5'-AGAGTATGATCATGGCTCAG-3'），R1492（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

擴增體系：ExTaq25.0 μL，F(xiàn)27和R1492引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 21.0 μL。按照程序95 ℃熱變性30 s；60 ℃變性1 min，72 ℃延伸150 s，循環(huán)35次后；72 ℃延伸10 min。以便得到足夠數(shù)量的目的DNA分子。

采用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列測定。所得測序核苷酸序列提交美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與Genebank中已知的16S rDNA核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，當(dāng)被檢菌株核苷酸序列與參考菌株同源性大于97%時，即確定為同一個菌種[23]。

1.3.7 乳酸菌代表菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

選取樣品ST8中分離的ST8-4、ST8-7、樣品ST11中分離的ST11-7、樣品ST17中分離的ST17-2、以及樣品ST23中分離的ST23-10、ST23-11和ST25-1作為代表菌株。將代表菌株的16S rDNA核苷酸測序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列同源性比對，選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列信息和α多樣性分析

由表1可知，6個辣椒酸樣品（ST8、ST11、ST17、ST21、ST23、ST25）由Illumina MiSeq測序共得到22 605個有效序列，553個OTUs其Coverage分別為93%、96%、93%、91%、96%和92%，樣品覆蓋度比較高，均在90%以上。樣品ST17的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，分別為2 936.468和1 136.115；說明其物種豐度最高。ST21的序列數(shù)、OTUs數(shù)目以及Shannon指數(shù)最高，分別為4 500、148和3.802；說明其物種多樣性在所有樣品中最高?？梢?，各個樣品之間微生物多樣性以及豐度存在一定差異。

表1 不同樣品中細(xì)菌菌群的α多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of bacterial community in different samples

根據(jù)Rarefaction數(shù)據(jù)繪制Rarefaction稀釋曲線，結(jié)果見圖1。當(dāng)cutoff值為0.03時，樣品ST17曲線處于上升趨勢。但從表1的Coverage可看出，樣品中細(xì)菌序列的覆蓋度達(dá)到了90%以上。說明該樣品在發(fā)酵過程中起主要作用的微生物已得到分析，物種測序深度已經(jīng)足夠。其余5個辣椒酸樣品Rarefaction稀釋曲線趨于平緩，說明其測序深度充分，基本可覆蓋到樣品中的所有物種。

圖1 序列相似度為97%細(xì)菌Rarefaction評估Fig.1 Rarefaction evaluation of bacteria with 97% sequence similarity

2.2 門水平細(xì)菌多樣性分析

從門水平對辣椒酸中細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。從圖2可知，辣椒酸中優(yōu)勢細(xì)菌門依次為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、類桿菌門（Bacteroidota）和Actinobacteriota，平均相對含量分別為77.9%、19.59%、1.21%和0.95%；其余細(xì)菌門相對含量均＜0.1%。

圖2 基于門水平辣椒酸中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of bacterial community structure in peper acid based on phylum level

其中厚壁菌門（Firmicutes）在樣品ST11和ST23中占絕對優(yōu)勢，相對含量分別為95.19%和97.66%。該細(xì)菌門在樣品ST8和ST17中相對含量也較高，為83.33%和88.66%；在樣品ST21中相對含量稍低，為49.38%；除了在樣品ST25中，厚壁菌門（Firmicutes）在每個樣品中相對含量均超過或接近50%。可見厚壁菌門（Firmicutes）為辣椒酸中的優(yōu)勢菌門。樣品ST25中，厚壁菌門（Firmicutes）相對含量為24.54%，在所有樣品中含量最低；而變形菌門（Proteobacteria）在該樣品中相對含量為69.01%，在所有樣品中含量最高。樣品ST8、ST17和ST21中變形菌門（Proteobacteria）相對含量也比較高，分別為13.66%、10.41%和43.71%；另外兩個樣品ST11和ST23中相對含量最低，分別為3.03%和2.01%。可見變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌門在不同辣椒酸中相對含量差異很大。

王琪琪等[6]對辣椒紅酸湯（即辣椒酸）中微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為樣品中的優(yōu)勢菌門。而本研究也發(fā)現(xiàn)了大量藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）的序列，但考慮到其序列為葉綠體的[24]，即辣椒酸發(fā)酵時加入新鮮紅辣椒所致。因此，并未歸為樣品細(xì)菌門當(dāng)中。

2.3 屬水平細(xì)菌多樣性分析

從屬水平對辣椒酸中細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，見圖3?？傮w上，辣椒酸樣品中相對含量＞1%的屬有乳酸桿菌（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬屬（Enterobacter）、Lelliottia、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），一共7個屬，平均相對含量分別為72.02%、5.59%、3.97%、5.30%、1.64%、1.07%和1.02%?？梢姡鳂悠分腥樗釛U菌屬（Lactobacillus）相對含量最高。單個樣品中，樣品ST8、ST11、ST17、ST21和ST23，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢菌屬，相對含量分別為67.74%、95.09%、83.95%、38.34%和95.01%。從乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對含量可看出，樣品ST11（95.09%）和ST23（95.01%）中該細(xì)菌屬占絕對優(yōu)勢，樣品ST17（83.95%）次之，樣品ST25（1.81%）中最低。而假單胞菌屬（Pseudomonas）和Lelliottia細(xì)菌屬在樣品ST25中相對含量較高，分別為27.23%和11.79%，該樣品的細(xì)菌多樣性和豐度比較分散。從以上數(shù)據(jù)可以看出乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為辣椒酸中的優(yōu)勢菌屬，與王琦琦等[6]研究結(jié)果一致。

圖3 基于屬水平辣椒酸中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in peper acid based on genus level

乳酸桿菌屬（Lactobacillus）作為乳酸菌中最大的一個屬，在人和動物腸道中維持著腸道的微生態(tài)平衡。同時有研究表明酸湯在改善胃腸道方面具有保健功能[4]。在辣椒酸樣品中，存在著大量的假單胞菌屬（Pseudomonas）和少量的葡萄球菌屬（Staphylococcus）。報道指出，隸屬于金黃色葡萄球菌屬（Staphylococcus aureus）[25]和銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginos）[26]部分“種”對人體產(chǎn)生一定的條件致病性。因此，在制作傳統(tǒng)發(fā)酵酸辣椒時需注意生產(chǎn)環(huán)境的影響作用。

2.4 乳酸菌鑒定結(jié)果

結(jié)合Illumina MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)，在分析辣椒酸樣品屬分類水平細(xì)菌多樣性時發(fā)現(xiàn)乳酸菌相對含量很高。為進(jìn)一步探明辣椒酸中的優(yōu)勢乳酸菌類群，利用MRS合成培養(yǎng)基對辣椒酸樣品中乳酸菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)果表明，從辣椒酸樣品中一共分離出了43株細(xì)菌。分別為34株乳酸菌、6株芽孢桿菌和3株葡萄球菌，分別占分離菌株的79.07%、13.95%和6.98%。其中分離出的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）最多，一共20株，該菌被認(rèn)為是影響泡菜感官品質(zhì)的重要菌之一[27]；其他分別為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）5株、枯草桿菌（Bacillussp.）4株、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）3株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和白色芽孢桿菌（Bacillus albus）各2株。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、乳酸桿菌（Lactobacillussp.）、葡萄球菌（Staphylo coccussp.）、免培養(yǎng)葡萄球菌（UnculturedStaphylococcussp.）、假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）和免培養(yǎng)乳酸桿菌（UnculturedLactobacillus）各1株。根據(jù)各樣品名稱，將其對應(yīng)分離的菌株進(jìn)行命名，其鑒定結(jié)果見表2。

表2 篩選菌種鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of screened strains

樣品ST8中分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）14株，戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）1株。向凡舒等[28]從酸豇豆中分離得到12株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）占分離菌株的92.3%，該菌在蔬菜發(fā)酵過程中起到重要的作用。徐莉等[29]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可有效抑制酸湯中雜菌的生長，可縮短發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)程，影響酸湯風(fēng)味。田永峰[4]從紅酸湯中分離出4株桿菌，研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌影響酸湯的營養(yǎng)價值和風(fēng)味。在酸湯發(fā)酵后期乳桿菌產(chǎn)生大量乳酸，可迅速降低發(fā)酵環(huán)境的pH，抑制其他菌群生長，乳桿菌成為最后的優(yōu)勢菌群。

樣品ST11中分離出植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）6株，乳酸桿菌（Lactobacillussp.）、葡萄球菌（Staphylococcussp.）、免培養(yǎng)葡萄球菌（UnculturedStaphylococcus sp.）和假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）各1株。其中葡萄球菌（Staphylococcussp.）和免培養(yǎng)葡萄球菌（UnculturedStaphylococcussp.）多數(shù)為非致病菌，但少數(shù)可導(dǎo)致疾病。提示傳統(tǒng)發(fā)酵食品中潛藏著一定的食品安全風(fēng)險，需引起重視。

樣品ST17分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）2株。樣品ST21為工業(yè)化辣椒酸成品，未分離出乳酸菌。顯然產(chǎn)品在出廠前進(jìn)行了活菌滅活處理[30]，用以保持產(chǎn)品風(fēng)味穩(wěn)定性和常溫保存時延長產(chǎn)品貨架期。樣品ST23中分離出副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）5株、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）3株、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）和免培養(yǎng)乳酸桿菌（UnculturedLactobacillus）各1株；樣品ST25分離出芽孢桿菌（Bacillussp.）4株，白色芽孢桿菌（Bacillus albus）2株。從以上辣椒酸中微生物分離結(jié)果可看出，不同樣品中分離出的細(xì)菌種類和數(shù)量基本都不相同。不同微生物在辣椒酸發(fā)酵時產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，造就了辣椒酸的不同風(fēng)味。

續(xù)表

2.5 代表菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

將隨機挑選同一個菌種名稱的菌株作為代表菌株ST8-4、ST8-7、ST11-7、ST11-10、ST17-2、ST23-10、ST23-11和ST25-1菌株的16S rRNA核苷酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。發(fā)現(xiàn)菌株ST8-7與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）8m-21呈現(xiàn)出較高的相似度；菌株ST8-4與戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CE14.15呈現(xiàn)出較高的相似度；菌株ST11-7和ST11-10與乳酸桿菌（Lactobacillussp.）THK-W4呈現(xiàn)出較高的相似度；菌株ST17-2與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）gp107呈現(xiàn)出較高的相似度；菌株ST23-10h與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）呈現(xiàn)出較高的相似度；菌株ST23-11與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）6664呈現(xiàn)出較高的相似度；菌株ST25-1與枯草桿菌（Bacillussp.）Pg 15呈現(xiàn)出較高的相似度。

圖4 代表菌株基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of representative strains based on 16S rRNA gene sequence

3 結(jié)論

本研究結(jié)合Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)和傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對凱里地區(qū)辣椒酸中微生物群落多樣性進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)凱里地區(qū)辣椒酸中優(yōu)勢門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），所占比例最大的優(yōu)勢屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。利用MRS培養(yǎng)基，采用純培養(yǎng)技術(shù)分離出的細(xì)菌多為乳酸桿菌，部分為芽孢桿菌以及少數(shù)葡萄球菌；且不同樣品分出的細(xì)菌種類基本不同。可能與辣椒酸生產(chǎn)環(huán)境以及生產(chǎn)工藝的不同相關(guān)。純培養(yǎng)分離的細(xì)菌當(dāng)中以植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）為主。由此可見，凱里地區(qū)辣椒酸中含有豐富的乳酸菌資源，有待進(jìn)一步的開發(fā)利用。