EB病毒陽(yáng)性的不同類型淋巴瘤組織中EBNA1多態(tài)性研究*

徐海芹， 馮征遠(yuǎn)， 徐曉艷 ， 孫亮亮

（1內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010010；3內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010010）

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在伯基特淋巴瘤、彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤、經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤及NK/T 細(xì)胞淋巴瘤中的檢出率顯著高于其他腫瘤，推測(cè)其可能在腫瘤發(fā)病過程中起到重要作用［1］。而Southern印跡（Southern blot）、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、免疫組織化學(xué)染色（IHC）和原位雜交（ISH）等技術(shù)的運(yùn)用，進(jìn)一步推動(dòng)了對(duì)EBV致瘤性基因表達(dá)及其致瘤機(jī)制的深入研究。

EBV 是一種線性雙鏈DNA 病毒，廣泛存在于人類中的嗜B 淋巴細(xì)胞，在全世界人群中感染非常普遍［2］。大量研究報(bào)道EBV 相關(guān)的腫瘤呈人種和地域分布性，其原因可能與遺傳、環(huán)境和／或病毒因素有關(guān)。由于不同來源的EBV毒株存在基因變異和生物學(xué)功能的差異，因此是否存在高致病EBV 變異毒株一直倍受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察15 例EBV 陽(yáng)性的不同類型淋巴瘤病例中EBV 核抗原1（EBV nuclear antigen 1，EBNA1）羧基端的變異情況，探討本地區(qū)EB 病毒與不同淋巴瘤之間的關(guān)系，以及觀察是否存在與其他地區(qū)不同的EBNA1羧基端變異情況。

材料和方法

1 一般資料

選內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009 年1 月至2013 年1 月間淋巴瘤標(biāo)本共15 例，年齡在12～81歲之間，男11例，女4例。所有病例均經(jīng)兩位以上病理專家復(fù)查后確診。

2 方法

采用酚、氯仿-異戊醇法常規(guī)提取EBV 陽(yáng)性細(xì)胞系 B95-8 和 EBV 陰性細(xì)胞系 Ramos 細(xì)胞 DNA，使用TIANamp FFPE DNA Kit 石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取石蠟包埋組織DNA，實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行，試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。依據(jù)B95-8 序列（基因序列號(hào)：V01555.1），應(yīng)用Primerpremier 5 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增EBNA1基因的引物，采用巢式PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢驗(yàn)PCR 擴(kuò)增是否成功，試劑購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司?；驕y(cè)序送北京華大基因有限公司

結(jié) 果

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和凝膠電泳結(jié)果

用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法對(duì)EBV 陽(yáng)性的淋巴瘤病例進(jìn)行EBNA1基因羧基端的擴(kuò)增，成功擴(kuò)增15 例，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。15 例中，其中經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤7 例、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤3 例、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤3 例、濾泡性淋巴瘤1例和T 淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤1 例。PCR 擴(kuò)增結(jié)果與EBER 陽(yáng)性結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，PCR 1、3和13號(hào)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物較少，其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為散在分布，小細(xì)胞（非腫瘤細(xì)胞）陽(yáng)性，2～3 個(gè)/HPF，兩種檢測(cè)結(jié)果一致；PCR 2和4號(hào)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物較少，EBER 的表達(dá)為彌漫分布，大細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）陽(yáng)，100個(gè)/HPF，兩種檢測(cè)結(jié)果不一致，可能是由于樣本保存問題，導(dǎo)致EBNA1 羧基端部分?jǐn)嗔阉?；PCR 5、6、8～12和15號(hào)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物較多，其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為彌漫分布，大細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）陽(yáng)，100 個(gè)/HPF，兩種檢測(cè)結(jié)果一致；PCR 7號(hào)樣本為濾泡性淋巴瘤，擴(kuò)增產(chǎn)物較多，其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為散在分布，小、中、大細(xì)胞（非腫瘤細(xì)胞）陽(yáng)，10～15 個(gè)/HPF，EBER 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較多，因此認(rèn)為兩種檢測(cè)結(jié)果一致；PCR 14號(hào)樣本為淋巴細(xì)胞為主型的經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤，擴(kuò)增產(chǎn)物較少，其相應(yīng)的EBER 表達(dá)為散在分布，大細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）陽(yáng)，陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞數(shù)整體看并不多，因此兩種檢測(cè)結(jié)果一致。綜上所述，EBNA1基因羧基端的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與EBER 表達(dá)情況基本一致，說明EBER 的表達(dá)常伴隨EBNA1 的表達(dá)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物較多的病例主要為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤，由此說明EBV 感染在不同類型淋巴瘤中的表達(dá)主要與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的發(fā)病有關(guān)，這與其他地區(qū)的研究結(jié)果一致。

2 上述淋巴瘤（圖1）EBNA1 基因羧基端突變熱點(diǎn)AA487及AA466-527之間的變異情況

Figure 1. The expression of carboxyl terminal of EBNA1 gene in 15 cases of lymphoma.圖1 15例淋巴瘤中EBNA1基因羧基端的表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)對(duì)有EBER 陽(yáng)性細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞）的淋巴瘤病例進(jìn)行EBNA1 基因羧基端的擴(kuò)增，成功擴(kuò)增15 例，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示（表1），其編碼產(chǎn)物為AA439-555，該段序列包含了以往研究中發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)AA487 及AA466-527 之間的變異。與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8相比，15例EBV 陽(yáng)性淋巴瘤組織標(biāo)本中EBNA1 羧基端均出現(xiàn)序列變異。1號(hào)（T）、2號(hào)（NK/T）、3 號(hào)（NK/T）、4 號(hào)（HL）、8 號(hào)（HL）、9 號(hào)（HL）、11 號(hào)（DL）、13 號(hào)（DL）、14 號(hào)（HL）和15 號(hào)（HL）樣本出現(xiàn)了錯(cuò)義突變AA487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V 和 533 L→I，無(wú)義突變?yōu)?AA 520 密碼子cat→ctc，與以往研究此段基因變異情況一致；5號(hào)（HL）樣本除了出現(xiàn)了共有突變：錯(cuò)義突變487 A→V（圖 2）、499 D→E、02 T→N、524 T→I、528 I→V 和533 L→I，無(wú)義突變?yōu)?AA 520 密碼子 cat→ctc 外，還出現(xiàn)了錯(cuò)義突變AA462 G→E、466 G→R和無(wú)義突變AA466 密碼子 gga→gaa；這與以往研究不同；6 號(hào)（DL）、7 號(hào)（FL）樣本除了出現(xiàn)了共有突變：錯(cuò)義突變487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V和 533 L→I，無(wú)義突變?yōu)?AA 520 密碼子 cat→ctc 外，還出現(xiàn)了無(wú)義突變?yōu)锳A 480 密碼子aac→atc 和AA 547 密碼子ccc→cct 突變，這與以往的研究不同；10號(hào)（NK/T）樣本只出現(xiàn)了499 D→E，這與以往的研究不同；12 號(hào)（HL）樣本出現(xiàn)了與共有突變不同的錯(cuò)義突變AA 487 A→L、492 S→C、502 T→N 和524 T→I。綜上所述，1 號(hào)、3 號(hào)和 13 號(hào)樣本 EBER 陽(yáng)性細(xì)胞為非腫瘤細(xì)胞，但是也均出現(xiàn)了共有突變，由此推測(cè)，這些EBNA1 羧基端突變是否誘發(fā)非腫瘤細(xì)胞釋放了腫瘤發(fā)生因子，從而促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生，或者這幾例淋巴瘤的發(fā)生與EBV 無(wú)關(guān)，EBV 感染只是一種潛伏狀態(tài)，而是通過其他途徑導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，又或者EBNA1 基因的變異與疾病無(wú)關(guān)，只與地區(qū)限制性有關(guān)，這有待于進(jìn)一步研究。7 號(hào)樣本EBER 陽(yáng)性細(xì)胞為非腫瘤細(xì)胞，除了出現(xiàn)共有突變外，還出現(xiàn)了非共有突變，這與此樣本EBER 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多并且EBNA1 擴(kuò)增產(chǎn)物也較多是否有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。5 號(hào)、6 號(hào)、10 號(hào)和 12 號(hào)樣本 EBER 陽(yáng)性細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，除了有部分共有突變外，均出現(xiàn)了非共有突變，這些突變可能是偶然事件，但也不能除外與腫瘤的發(fā)生有關(guān)或是由于地域差異導(dǎo)致，有待于進(jìn)一步研究。

表1 15例淋巴瘤的EBNA1羧基末端基因變異情況Table 1. Variation of EBNA1 carboxyl terminal gene in 15 cases of lymphoma

討 論

近年來EBV是研究較多的與腫瘤密切相關(guān)的一種致腫瘤生物因素。EBV 基因組至少有85 個(gè)可編碼基因，這些基因可在EBV 感染的潛伏階段或裂解階段表達(dá)。因?yàn)镋BV潛伏感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力是其致癌的基礎(chǔ)，所以目前測(cè)序分析主要是針對(duì)EBV 潛伏期基因。潛伏期表達(dá)的基因主要包括2 種EBV 編碼小 RNA（EBV-encoded small RNAs，EBERl 和 EBER2）；6種核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA）家族，包括 EBNAl、2、3A、3B、3C 和主導(dǎo)蛋白（1eader protein，EBNA-LP）；潛伏膜蛋白（1atent membrane protein，LMP1）1、2A 和 2B 以及 BamHI-A 右向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（BamHI-A rightward transcripts，BARTs）［3］。 在裂解性感染時(shí)，大量的病毒結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因［4-5］。

目前已知EBV多種潛伏期基因編碼產(chǎn)物可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其中核抗原家族基因（EBNAs）編碼產(chǎn)物中的EBNA1 是唯一在所有EBV 相關(guān)腫瘤中均表達(dá)的蛋白，近年來研究表明，不同的腫瘤又表現(xiàn)不同的潛伏模式，I 型潛伏感染的有胃癌及Burkitt 淋巴瘤，表達(dá)EBER和EBNA1；II型潛伏感染的有霍奇金淋巴瘤HL、鼻咽癌及NK/T 細(xì)胞淋巴瘤，表達(dá)LMP1、LMP2A、LMP2B、EBNA1 和 EBER；III 型潛伏感染主要見于彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（DCBCL）及免疫抑制患者的淋巴組織增生性疾病，病毒表達(dá)所有的EBNAs、LMPs、EBERs 和 BARTs；IV 型潛伏感染僅發(fā)生在健康病毒攜帶者的B 細(xì)胞淋巴細(xì)胞中，病毒表達(dá)LMP2A、EBERs 和BARTs。由此可見除了健康病毒攜帶者外，其他EBV 陽(yáng)性的腫瘤性患者中均可檢測(cè)到EBNA1和EBER基因。由于原位雜交的方法（檢測(cè)EBER）不需要昂貴的儀器，操作較簡(jiǎn)單、不易污染，因此目前臨床病理診斷中常規(guī)是用原位雜交的方法檢測(cè)EBV。本研究采用PCR 方法檢測(cè)EBNA1，雖然檢測(cè)結(jié)果與原位雜交一致，但是PCR 產(chǎn)物可以進(jìn)一步研究EBNA1基因多態(tài)性，而且PCR 方法靈敏度高，更易檢出陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)病毒潛伏感染時(shí)，其在基因組的維持、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用［6］。EBNA1 重復(fù)序列可通過順式作用方式抑制抗原遞呈細(xì)胞對(duì)自身的加工處理，使CTL 不能識(shí)別自身免疫表位從而逃避機(jī)體免疫應(yīng)答［7］。EBNA1 由N 端（AA1-89）、甘氨酸和丙氨酸重復(fù)序列（AA 90-327）以及C端（AA328-641）組成，對(duì)EBNA1基因變異的分析多集中在 C 端［8-9］。因此，本研究對(duì) EBV 陽(yáng)性淋巴瘤組織中EBNA1編碼基因C端的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)和分析，旨在探討EBNA1 多態(tài)性在EBV 陽(yáng)性淋巴瘤發(fā)生中的意義。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR 方法對(duì)有EBER 陽(yáng)性細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞）的淋巴瘤病例進(jìn)行EBNA1基因羧基端的擴(kuò)增，成功擴(kuò)增15例，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EBNA1基因羧基端的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與EBER 表達(dá)情況基本一致，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物較多的病例主要為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤，由此說明EBV感染在不同類型淋巴瘤中的表達(dá)主要與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤有關(guān)，這與其他地區(qū)的研究結(jié)果一致；同時(shí)也說明EBER 與EBNA1 常常伴隨表達(dá)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物較少的幾乎是伴有EBV 潛伏感染的淋巴瘤病例，EBV 在這些淋巴瘤中可能只屬于伴隨情況，為非致瘤性。

Figure 2. Mutation of aa487 at C-terminal of EBNA1 gene in some lymphomas. A：negative control（wild type）；B：mutation of aa487 at the carboxyl end of EBNA1 gene in sample 5 of classical Hodgkin′s lymphoma（GCT→GTT，that was A→V）.圖2 部分淋巴瘤中EBNA1基因C端AA487位點(diǎn)的突變情況

將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示，其編碼產(chǎn)物為AA439-555，該段序列包含了以往研究中發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)AA487 及AA466-527之間的變異。與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8 相比，15 例EBV 陽(yáng)性淋巴瘤組織標(biāo)本中EBNA1 羧基端均出現(xiàn)序列變異。幾例非腫瘤細(xì)胞EBER陽(yáng)性的淋巴瘤，也均出現(xiàn)了與以往研究相同的共有突變［10］，由此推測(cè)，這些EBNA1羧基端突變是否誘發(fā)非腫瘤細(xì)胞釋放了腫瘤發(fā)生因子，從而促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生，或者這幾例淋巴瘤的發(fā)生與EBV無(wú)關(guān)，EBV感染只是一種潛伏狀態(tài)，而是通過其他途徑導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，這有待于進(jìn)一步研究。而腫瘤細(xì)胞EBER 陽(yáng)性的淋巴瘤樣本中除了有部分共有突變外，均出現(xiàn)了非共有突變，這些突變可能是偶然事件，也可能由于地域差異導(dǎo)致，或是某種類型淋巴瘤的致瘤原因，有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，EBV 基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，表達(dá)的蛋白及基因產(chǎn)物較多。其與多數(shù)腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，目前針對(duì)淋巴瘤的研究較多。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)淋巴瘤病例中EBNA1 羧基端變異類型與其他地區(qū)除了有部分共有突變外，均出現(xiàn)了非共有突變，這些突變可能是偶然事件，也不可能除外與腫瘤的發(fā)生有關(guān)或由于地域差異導(dǎo)致，為探索EBV 的致病機(jī)制提供了一定價(jià)值。